牛孤雄胚早期發(fā)育過程中組蛋白乙?；恼{(diào)控作用研究.pdf

1、在哺乳動(dòng)物中，雄性的繁殖效率遠(yuǎn)高于雌性，因而對(duì)雄性動(dòng)物進(jìn)行選擇的強(qiáng)度大，育種效果好。理論上，用孤雄生殖技術(shù)構(gòu)建的胚胎擁有兩套父源遺傳物質(zhì)，如果胚胎能完成整個(gè)發(fā)育過程、直至出生，則可通過引進(jìn)凍精來實(shí)現(xiàn)最優(yōu)種公畜個(gè)體的引種和擴(kuò)繁，實(shí)現(xiàn)新品種的培育。然而，由于孤雄胚胎只含有單親基因組，所以胚胎存活力極低，是否存在某些等位印記基因的親緣特異性表達(dá)和異常的表觀遺傳修飾問題，尚無定論。本研究比較了牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚在體外培養(yǎng)條件下的發(fā)育率

2、、組蛋白H3和H4乙酰化水平的變化規(guī)律、發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況，進(jìn)一步利用組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砼９滦叟?，觀察其對(duì)胚胎發(fā)育率的影響、分析處理后胚胎中組蛋白H3和H4乙?；胶湍遗哔|(zhì)量的變化情況，以探討牛孤雄胚早期發(fā)育過程中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，為開發(fā)提高牛孤雄胚早期發(fā)育率的新方法奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.牛孤雄胚早期發(fā)育能力及其與孤雌胚和體外受精胚的比較
　　比較牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚在相同培養(yǎng)體系下發(fā)

3、育至2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8～16-細(xì)胞、桑葚胚和囊胚階段的比率，發(fā)現(xiàn):在2-細(xì)胞到囊胚胚階段，孤雄胚的發(fā)育能力顯著低于體外受精胚和孤雌胚，特別是囊胚發(fā)育率，孤雄胚只有7.79±0.97％，顯著低于體外受精胚（36.37±1.17％）和孤雌胚(42.32±0.68％)(p＜0.05)，說明牛孤雄胚的早期體外發(fā)育能力顯著低于體外受精胚和孤雌胚。
　　2.牛孤雄胚早期發(fā)育過程中組蛋白H3和H4乙?；降淖兓?guī)律及其與孤雌胚和體外受精胚

4、的比較
　　應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光染色的方法，比較牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚在相同培養(yǎng)體系下發(fā)育至2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、16-細(xì)胞、桑葚胚和囊胚中的組蛋白H3和H4整體乙?；郊捌渥兓?guī)律，發(fā)現(xiàn):
　　(1)牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚早期發(fā)育過程中組蛋白H3乙酰化水平的變化:在2-細(xì)胞和4-細(xì)胞階段，牛孤雄胚、體外受精胚和孤雌胚中組蛋白H3的乙?；礁叩拖嗷ケ容^均無顯著差異;在8-細(xì)胞階段孤雄胚中組蛋白H3的乙?；?/p>

5、水平與體外受精胚或孤雌胚相比差異不顯著，不過此階段孤雌胚中的組蛋白H3乙?；斤@著高于體外受精胚(p＜0.05);在16-細(xì)胞階段孤雄胚中組蛋白H3的乙?；斤@著低于體外受精胚(p＜0.05)，但孤雄胚中組蛋白H3的乙?；脚c孤雌胚相比差異不顯著;在桑葚胚和囊胚階段的孤雄胚中組蛋白H3的乙?；骄@著低于體外受精胚和孤雌胚(p＜0.05)，孤雌胚與體外受精胚中的組蛋白H3的乙?；讲町惥伙@著。在整個(gè)早期胚胎體外發(fā)育過程中，孤

6、雄胚、孤雌胚和體外受精胚中組蛋白H3的乙酰化水平變化規(guī)律均呈先下降后上升的趨勢(shì)，孤雄胚和孤雌胚組蛋白H3的乙酰化水平均在16-細(xì)胞階段左右達(dá)到最低水平，而體外受精胚組蛋白H3的乙?；皆?-細(xì)胞階段左右達(dá)到最低水平。
　　(2)牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚早期發(fā)育過程中組蛋白H4乙?；降淖兓?在2-細(xì)胞和4-細(xì)胞階段，牛孤雄胚、體外受精胚和孤雌胚中組蛋白H4的乙?；礁叩拖嗷ケ容^也均無顯著差異;在8-細(xì)胞階段孤雄胚中組蛋白

7、H4的乙?；斤@著低于體外受精胚和孤雌胚(p＜0.05)，但此階段的孤雌胚和體外受精胚中組蛋白H4乙?；讲町惒伙@著;在16-細(xì)胞、桑葚胚和囊胚階段孤雄胚中組蛋白H4的乙?；斤@著低于體外受精胚(p＜0.05)，不過孤雄胚中組蛋白H4的乙?；脚c孤雌胚相比差異不顯著，孤雌胚與體外受精胚相比差異也不顯著。在整個(gè)早期胚胎體外發(fā)育過程中，孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚中組蛋白H4的乙?；阶兓?guī)律也都呈先下降后上升的趨勢(shì)，孤雄胚組蛋白H

8、4的乙?；皆?-細(xì)胞階段左右達(dá)到最低水平，而孤雌胚和體外受精胚組蛋白H4的乙酰化水平均在4-細(xì)胞階段左右達(dá)到最低水平。
　　以上研究結(jié)果表明，牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚早期發(fā)育過程中組蛋白H3和H4乙?；匠蕜?dòng)態(tài)變化且在3種胚胎之間存在差異;孤雄胚在早期胚胎發(fā)育過程中整體乙酰化水平偏低，這可能是導(dǎo)致其發(fā)育效率低下的因素之一。
　　3.牛孤雄生殖囊胚中發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)及其與孤雌胚和體外受精胚的比較
　　應(yīng)用熒光

9、定量PCR方法檢測(cè)牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚囊胚中發(fā)育潛能基因（OCT4和CDX2）、印記基因(父系印記母源表達(dá)基因:H19和IGF2R;母系印記父源表達(dá)基因:IGF2和SNRPN)和組蛋白去乙?；{(diào)控基因(HDAC1和HDAC2)的mRNA表達(dá)水平的差異，發(fā)現(xiàn):
　　(1)發(fā)育潛能基因的表達(dá):孤雄胚中OCT4基因的mRNA表達(dá)水平顯著低于體外受精胚和孤雌胚(p＜0.05)，孤雌胚和體外受精胚中OCT4基因的mRNA表達(dá)水平差異

10、不顯著;孤雄胚和體外受精胚中CDX2基因的mRNA表達(dá)水平差異不顯著，但孤雄胚中CDX2基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于孤雌胚(p＜0.05)。
　　(2)印記基因的表達(dá):孤雄胚中父系印記母源表達(dá)基因H19和IGF2R的mRNA表達(dá)水平均顯著低于體外受精胚(p＜0.05)，相反，孤雌胚中H19和IGF2R基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于體外受精胚(p＜0.05);孤雄胚的母系印記父源表達(dá)基因IGF2的mRNA表達(dá)水平顯著高于體外受精胚

11、(p＜0.05)，不過孤雄胚中另一種母系印記父源表達(dá)基因SNRPN的mRNA表達(dá)水平卻顯著低于體外受精胚(p＜0.05)，孤雌胚中IGF2和SNRPN的mRNA表達(dá)水平均顯著低于體外受精胚(p＜0.05)。
　　(3)組蛋白去乙?；{(diào)控基因的表達(dá):牛孤雄胚中組蛋白去乙酰化調(diào)控基因HDAC1和HDAC2的mRNA表達(dá)水平均顯著高于體外受精胚的表達(dá)量(p＜0.05)，但孤雄胚和孤雌胚中兩基因的表達(dá)水平差異不顯著。
　　以上研究結(jié)

12、果表明，牛孤雄胚、孤雌胚和體外受精胚囊胚中調(diào)控胚胎發(fā)育的基因存在表達(dá)差異，發(fā)育潛能基因、印記基因和組蛋白去乙?；刚{(diào)控基因的異常表達(dá)可能與牛孤雄胚早期胚胎發(fā)育能力低下有關(guān)。
　　4組蛋白去乙?；敢种苿┨幚韺?duì)牛孤雄胚發(fā)育效率的影響
　　以牛孤雄胚早期發(fā)育可能存在異常的表觀修飾為起點(diǎn)，應(yīng)用調(diào)控早期胚胎發(fā)育的組蛋白去乙?；敢种苿?TSA和SCR)處理所構(gòu)建的牛孤雄胚，檢測(cè)牛孤雄胚不同時(shí)期的發(fā)育率，分析其與去乙?；敢种苿舛取?/p>

13、處理時(shí)間以及處理方式的關(guān)系，研究結(jié)果如下:
　　(1)抑制劑處理濃度影響胚胎發(fā)育率:分別利用6個(gè)濃度的TSA(0、5、10、20、50和100nM/L)或SCR(0、50、100、200、300和500nM/L)在孤雄胚激活后的培養(yǎng)階段處理15h，發(fā)現(xiàn)較低濃度的TSA(5～20nM/L)或SCR（50～200nM/L）能夠顯著改善孤雄胚發(fā)育到8～16細(xì)胞、桑椹胚和囊胚的比率(p＜0.05);高濃度的TSA(100nM)或SCR(5

14、00nM)處理孤雄胚不利于其發(fā)育，甚至從2細(xì)胞階段開始已經(jīng)影響到胚胎的發(fā)育效率，降低了處理后胚胎的存活率，而且使胚胎發(fā)生胞質(zhì)碎裂的比率顯著上升(p＜0.05)。這表明，組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砉滦叟吆笈咛サ陌l(fā)育能力與抑制劑的處理濃度密切相關(guān)，20nMTSA或200nMSCR是有益于孤雄胚發(fā)育的最適濃度。
　　(2)抑制劑處理時(shí)間長短影響胚胎發(fā)育:發(fā)現(xiàn)用20nMTSA在孤雄胚激活后的培養(yǎng)階段分別處理0、10、15、20和25h后，

15、其囊胚發(fā)育比率分別為10.45±0.82％，12.59±1.16％，18.29±1.03％，16.83±0.85％和8.35±1.35％;200nMSCR處理孤雄胚0，10，15，20和25h后，其囊胚發(fā)育比率分別為10.45±0.82％，11.29±0.77％，19.84±1.05％，17.37±1.31％和14.07±1.28％。這說明，孤雄胚的發(fā)育能力與組蛋白去乙?；敢种苿┨幚淼臅r(shí)間長短密切相關(guān)，處理時(shí)間過短或偏長都不利于孤雄胚

16、發(fā)育，兩種抑制劑處理的最適時(shí)間長度均在15～20h。
　　(3)抑制劑處理方式影響胚胎發(fā)育率:用三種方式處理孤雄胚，發(fā)現(xiàn):方案1(在胚胎構(gòu)建后修整期用20nMTSA(或200nMSCR)處理2h+胚胎激活階段4h+培養(yǎng)階段9h)和方案2(胚胎激活期抑制劑處理4h+培養(yǎng)階段11h)處理胚胎后，胚胎發(fā)育至桑椹胚和囊胚階段的比率均低于方案3(胚胎激活后培養(yǎng)階段抑制劑處理15h)。所有用20nMTSA或200nMSCR處理的方案中，胚胎發(fā)

17、育至桑椹胚和囊胚的比率均高于未處理的對(duì)照組。這表明，在培養(yǎng)階段開始用蛋白去乙?；敢种苿┨幚砼咛グl(fā)育效果較好。
　　5組蛋白去乙?；敢种苿┨幚韺?duì)牛孤雄生殖囊胚中組蛋白H3和H4乙?；揭约澳遗哔|(zhì)量的影響
　　(1)應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光染色的方法比較用組蛋白去乙?；敢种苿?20nMTSA或200nMSCR)處理牛孤雄胚后，發(fā)育至囊胚階段胚胎的組蛋白H3和H4整體乙酰化水平的改變情況。結(jié)果表明，200nMSCR處理孤雄胚后囊胚

18、中的組蛋白H3的整體乙?；斤@著高于未處理的對(duì)照組孤雄胚(p＜0.05)，20nMTSA處理組囊胚的H3的整體乙?；揭哺哂趯?duì)照組;20nMTSA或200nMSCR處理孤雄胚后囊胚中的組蛋白H4的整體乙酰化水平均顯著高于未處理的對(duì)照組孤雄胚(p＜0.05)。這說明，組蛋白去乙?；敢种苿┰谂囵B(yǎng)階段處理牛孤雄胚可以提高囊胚階段胚胎的組蛋白H3和H4的整體乙?；?。
　　(2)應(yīng)用囊胚區(qū)分染色的方法比較分析組蛋白去乙?；敢种苿?/p>

19、(20nMTSA或200nMSCR)處理牛孤雄胚后，發(fā)育至囊胚階段胚胎的質(zhì)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在胚胎激活后培養(yǎng)階段用200nMSCR對(duì)孤雄胚處理15h左右，發(fā)育至第8天的囊胚總細(xì)胞數(shù)、ICM細(xì)胞數(shù)、TE細(xì)胞數(shù)和ICM/TE比率均顯著高于未處理的對(duì)照組胚胎(p＜0.05);而用另一種抑制劑，20nMTSA處理孤雄胚后，其囊胚質(zhì)量也得到改善。這表明組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砉滦叟吣芨纳破淠遗哔|(zhì)量，SCR的處理效果要優(yōu)于TSA。
　　本研究的

20、主要結(jié)論:在相同體外培養(yǎng)體系下，牛孤雄胚的發(fā)育能力顯著低于體外受精胚和孤雌胚;組蛋白H3和H4整體乙?；皆谶@三種胚胎的早期發(fā)育過程中存在差異，且呈動(dòng)態(tài)變化，孤雄胚在早期胚胎發(fā)育過程中組蛋白整體乙?；脚c體外受精胚和孤雌胚相比較低，這可能是導(dǎo)致其早期體外發(fā)育能力低下的因素之一;此外，影響和調(diào)控牛早期胚胎發(fā)育的基因在牛孤雄、孤雌和體外受精囊胚中的mRNA表達(dá)水平存在差異，發(fā)育潛能基因表達(dá)缺陷、印記基因和組蛋白去乙?；刚{(diào)控基因的表達(dá)異

21、?？赡芘c牛孤雄胚發(fā)育缺陷有關(guān)。利用組蛋白去乙?；敢种苿?duì)孤雄胚處理，能促進(jìn)胚胎發(fā)育，特別是發(fā)育到桑葚胚和囊胚的能力，20nMTSA或200nMSCR是處理孤雄胚的最適濃度，處理較適宜的時(shí)間是在胚胎激活后的培養(yǎng)階段，處理適宜時(shí)間長度為15h左右;利用組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA或SCR處理后得到的囊胚中組蛋白H3和H4整體乙酰化水平升高，其囊胚質(zhì)量也得到改善，這說明組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砼咛タ梢宰鳛轶w外快速高效構(gòu)建孤雄胚的有效手段之