番茄YABBY家族轉錄因子的克隆、表達模式分析及其功能研究.pdf

1、YABBY蛋白家族是一種植物中所特有的轉錄因子,具有典型的N端C2C2型鋅指結構域和C端螺旋環(huán)螺旋YABBY保守結構域,在大多數(shù)的高等植物的生長發(fā)育以及形態(tài)建成方面發(fā)揮著重要的生物學功能。目前,該家族基因在模式生物擬南芥中的功能研究比較清楚,但在番茄中分子機制仍不是很清楚,研究YABBY家族基因在番茄生長發(fā)育進程中的生物學功能具有重要意義。本研究篩選了番茄YABBY家族中的幾個緊密相關的轉錄因子分別命名為SlYABBY5、SlYABBY

2、1b和SlYABBY2a,利用qRT-PCR技術研究了此三個基因在番茄各組織中的表達模式分析;在ABA、ASA、IAA、GA3等外源激素處理以及低溫、高鹽和葉傷害等逆境脅迫下的表達分析。此外,分別構建了SlYABBY1b和SlYABBY2a基因的沉默表達載體,以及SlYABBY2a超表達載體,通過農(nóng)桿菌轉化的方法分別將SlYABBY1b和SlYABBY2a所構建的沉默載體和超表達載體轉入番茄基因組中,經(jīng)抗生素篩選以及PCR鑒定,獲得相應

3、的番茄轉基因株系,并對轉基因番茄的生長發(fā)育進行了表型觀察,進行了相關基因的表達研究,對其功能進行初步分析。主要研究內(nèi)容和結果如下:
　　1、從NCBI數(shù)據(jù)庫中分別獲得 SlYABBY5(GenBank登錄號:AK246138)、SlYABBY1b(GenBank登錄號:AK326840)和 SlYABBY2a(GenBank登錄號:AK328263)基因序列及其所編碼的氨基酸殘基,并利用RT-PCR的方法克隆了包含完整ORF的Sl

4、YABBY5基因,克隆了用于構建沉默載體的SlYABBY1b和SlYABBY2a基因的特異片段和用于構建超表達載體的包含完整ORF的SlYABBY2a的基因。所獲得的基因片段分別連入 pGEM?-T-easy-vector克隆載體,經(jīng) PCR驗證和測序驗證,所克隆的基因片段序列正確。
　　2、提取野生型番茄AC++各組織材料以及rin和Nr突變體的果實材料的總RNA,采用反轉錄酶和寡聚dT合成cDNA第一鏈。利用qRT-PCR的方

5、法進行AC++野生型番茄各組織表達模式分析,利用Nr和rin的果實成熟突變體進行果實成熟各時期表達模式分析。結果表明,SlYABBY5、SlYABBY1b和SlYABBY2a均在番茄根和莖中表達量極低,但在番茄葉組織、果實組織、萼片和花組織中均呈現(xiàn)組成型表達,在不同組織中的表達有明顯的差異;在Nr和rin果實成熟突變體中與野生型番茄相比無明顯差異,且具有類似的表達趨勢。
　　3、選取四周大小的野生型番茄葉組織為材料,利用IAA、A

6、BA、GA3和ASA等激素處理番茄幼苗,qRT-PCR方法分析表明,SlYABBY5、SlYABBY1b和SlYABBY2a三個基因的表達均受到抑制;利用低溫、高鹽和機械損傷等處理幼苗,SlYABBY1b基因的表達也受到了明顯的抑制;而SlYABBY5和 SlYABBY2a基因受低溫脅迫的抑制,而其表達水平受高鹽和葉傷害脅迫的誘導。
　　4、利用所克隆的SlYABBY1b基因的特異序列構建了RNAi介導的番茄pBIN19::SlY

7、ABBY1b沉默載體,經(jīng)PCR和酶切驗證正確后,利用農(nóng)桿菌介導的方法將沉默載體重組入番茄基因組中,經(jīng)過Kan抗性篩選以及PCR驗證的方法來篩選陽性轉基因株系,經(jīng)過驗證獲得了5個陽性的轉基因株系;利用qRT-PCR技術,檢測SlYABBY1b基因在所篩選出的所有的轉基因株系中的表達情況,檢測到該基因的表達水平均被明顯的下調(diào)。
　　5、利用所克隆的SlYABBY2a的特異基因片段構建 RNAi介導的番茄pBIN19::SlYABBY2

8、a沉默載體,利用所克隆的包含完整ORF的SlYABBY2a的特異片段構建pBI121::SlYABBY2a超表達載體,經(jīng)酶切和PCR驗證正確后,利用農(nóng)桿菌介導的方法侵染番茄子葉,分別將沉默和超表達載體重組入番茄基因組,采用Kan抗性篩選和PCR驗證的方法篩選出陽性轉基因株系,驗證分別獲得了2個超表達和5個沉默的轉基因株系;利用qRT-PCR技術檢測SlYABBY2a基因分別在超表達和沉默轉基因株系中的表達量,結果顯示,在2個超表達轉基因

9、株系中SlYABBY2a基因的表達水平均被明顯上調(diào),而該基因在沉默轉基因株系中其表達量明顯下降。
　　6、利用SlYABBY1b部分轉基因材料分別進行生長素途徑和赤霉素合成途徑相關基因的檢測,研究表明,IAA3、IAA9、ARF7、ARF8和PIN4在RNAi介導的沉默轉基因番茄中表達水平與野生型番茄相比均被下調(diào)。其中,IAA3、IAA9和ARF8的表達在轉基因株系RNAi2＃中被下調(diào)的水平比RNAi4＃株系明顯。氧化酶基因GA2