四個番茄果實成熟相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的功能研究.pdf

1、果實成熟是一個涉及到一系列的生理和生化變化的高度程序化調(diào)控的復(fù)雜的生物學(xué)過程。為了探索躍變型和非躍變型果實共有的成熟調(diào)控機理，可以將果實成熟分成乙烯調(diào)控部分和非乙烯調(diào)控部分。本研究分別從這兩個方面入手，采用轉(zhuǎn)基因超表達(dá)和沉默乙烯反應(yīng)因子LeERF5，研究其對果實成熟的調(diào)控機理；同時利用基因芯片的方法，對番茄野生型AC++、番茄果實成熟突變體Cnr、rin和nor不同時期的果實進(jìn)行表達(dá)分析。并通過信號途徑分析等信息學(xué)手段，篩選出在不同突變

2、體和果實不同時期之間存在表達(dá)差異的轉(zhuǎn)錄因子。通過分子生物學(xué)和植物生理生化等方法分析這些表達(dá)差異轉(zhuǎn)錄因子在果實成熟過程中的作用，從而建立果實成熟的信號網(wǎng)絡(luò)。
　　 本研究取得的主要結(jié)果如下：第一部分：乙烯反應(yīng)因子LeERF5基因功能研究結(jié)果：
　　 在番茄野生型AC++中，LeERF5基因的相對表達(dá)量隨著果實的生長發(fā)育和成熟而下降，隨著葉片的生長發(fā)育和衰老而表達(dá)增強；傷害、干旱和復(fù)水、淹水、高溫和低溫、鹽脅迫、乙烯和ABA

3、均可以誘導(dǎo)LeERF5基因的表達(dá)。
　　 為了研究LeERF5的功能，利用CaMV的35S啟動子和終止子，構(gòu)建了LeERF5基因超表達(dá)載體pBIN19-LeERF5。通過桿菌介導(dǎo)法將LeERF5基因轉(zhuǎn)入了番茄野生型AC++中。通過抗性篩選獲得了69個獨立轉(zhuǎn)化株系，即F501-F569。對其中的39個轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行的Southern分析，發(fā)現(xiàn)在陽性LeERF5轉(zhuǎn)基因植株基因組中，轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)大部分為2-3個。僅有3個植株為單拷貝，

4、一個植株為4個拷貝。同時，Northern檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)505等14株為LeERF5基因超標(biāo)達(dá)植株，而另外的F501等14株轉(zhuǎn)基因植株為LeERF5基因的沉默植株。
　　 在LeERF5基因的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中，早期出現(xiàn)很明顯的側(cè)芽，而且側(cè)芽數(shù)在4個或者以上。后期比對照AC++植株矮小。LeERF5基因超表達(dá)植株沒有明顯的抗灰霉病和煙草花葉病毒的特性。以LePR-1，LePR-5，LePR-NP24的特異片段為探針進(jìn)行。Nor

5、thern分析，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)LeERF5基因番茄株系和番茄野生型中這些基因的表達(dá)沒有明顯差異。但是，LeERF5基因超表達(dá)植株的葉片相對含水量高于WT，且在干旱時，其葉片中游離脯氨酸的含量明顯高于WT。LeERF5基因超表達(dá)株系與WT相比，抗旱性明顯獲得提高，耐鹽性獲得增強。
　　 因此，LeERF5基因的功能與番茄應(yīng)對非生物因子的抗逆性密切相關(guān)。第二部分：番茄非乙烯信號途徑果實成熟相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果：
　　 通過A

6、ffymetrix基因芯片分析，并利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析方法，建立了番茄轉(zhuǎn)錄因子的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并選取了其中的3個基因作為備選基因(基因3059、基因3948和基因93613)進(jìn)行驗證研究。qPCR結(jié)果顯示，3個備選基因在番茄野生型AC++和番茄果實成熟突變體Cnr、rin中表達(dá)差異明顯，且三個基因之間的表達(dá)模式不同。利用Gateway的方法構(gòu)建了基因3059的超表達(dá)載體以及基因3059、基因3948和基因93613的RNAi沉默載體。利

7、用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了轉(zhuǎn)基因植株，并通過qPCR的方法對轉(zhuǎn)基因植株的基因表達(dá)量進(jìn)行了分析，分別獲得了基因3059的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株、Co-suppression株系和RNAi株系；基因3948的RNAi株系；基因93613的RNAi株系。
　　 基因3059、基因3948和基因93613沉默株系的表型以及可視化VIGS結(jié)果與陽性對照PSY1基因相似，果實呈現(xiàn)近乎白化。而基因3059超表達(dá)株系的果實呈現(xiàn)出深綠色果實，Co-suppr

8、ession的果實與RNAi沉默株系果實相同，呈現(xiàn)近乎白化果實。且基因3059的RNAi和Co-suppression株系的花瓣出現(xiàn)了維管束白化的現(xiàn)象；而莖和果柄之間的離層也出現(xiàn)了顏色變化。
　　 基因3059的超表達(dá)可以使中果皮外層細(xì)胞的葉綠體數(shù)量增多且顏色加深，也可以使中果皮內(nèi)層細(xì)胞的葉綠體顏色加深。其果實的葉綠素含量增加了3倍以上；而RNAi和Co-suppression植株果實葉綠素則下降了約30％。果實成熟后，基因30