家蠶黃紅繭系繭色形成機(jī)理研究.pdf

1、根據(jù)繭絲主要呈色色素的種類和含量，家蠶彩色繭品種主要分為黃紅繭系和綠繭系兩大類。黃紅繭系品種繭絲的主要呈色色素為類胡蘿卜素。家蠶自身不能合成類胡蘿卜素，只能從桑葉中獲取。桑葉中的類胡蘿卜素，透過中腸，穿過血液，進(jìn)入絲腺與絲膠結(jié)合才能使繭絲呈色。這個過程受到黃血基因Y，黃血抑制基因I，黃繭基因C和肉色繭基因F等多種基因的調(diào)控。
　　目前已知CBP、Cameo2和SCRB15分別為Y、C和F基因的產(chǎn)物。CBP與Cameo2一起控制黃繭

2、的形成，而CBP和SCRB15則一同控制肉色繭的形成。除了黃色和肉色外，家蠶黃紅繭的繭絲還擁有許多美麗的顏色，就是同種色系不同家蠶品種繭絲的顏色深淺也有不同。那么，家蠶黃紅繭系繭絲色彩的差異與類胡蘿卜素的種類和含量有什么關(guān)系？家蠶體內(nèi)類胡蘿卜素的積累是如何影響黃紅繭系繭色形成的？已克隆的黃繭和肉色繭形成相關(guān)基因與其他繭色的形成是否有關(guān)，它們是如何調(diào)節(jié)類胡蘿卜素在家蠶體內(nèi)轉(zhuǎn)運的？是否還有其他的類胡蘿卜素轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)因子參與繭色的形成？這些問題

3、的解答將有助于闡明家蠶黃紅繭系繭色形成機(jī)制，為天然彩色繭資源的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)，同時還能為哺乳動物以及人類體內(nèi)類胡蘿卜素吸收代謝的研究提供參考。
　　本研究在不同繭色家蠶品種間，比較了類胡蘿卜素體內(nèi)積累與黃紅繭繭色形成之間的關(guān)系:分析了家蠶體內(nèi)類胡蘿卜素積累與繭色形成相關(guān)基因表達(dá)的相互關(guān)系;在細(xì)胞水平，對黃紅繭形成相關(guān)蛋白的類胡蘿卜素轉(zhuǎn)運功能進(jìn)行了初步探索;最后分離純化了銹繭品種03-520絲腺組織中的類胡蘿卜素結(jié)合蛋白。主

4、要研究結(jié)果如下:
　　1.家蠶體內(nèi)類胡蘿卜素積累與繭絲呈色的關(guān)系
　　采用RP-HPLC-DAD法對桑葉和不同繭色家蠶品種幼蟲末齡的中腸、血液、絲腺以及繭絲中的類胡蘿卜素進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果表明:(1)桑葉、蠶體和黃紅繭系繭絲中的主要類胡蘿卜素的種類相同，均為葉黃素、β-胡蘿卜素和紫黃質(zhì)。(2)葉黃素與β-胡蘿卜素的含量比與繭絲顏色的深淺有關(guān)，葉黃素與β-胡蘿卜素的含量比越高，繭絲的顏色越黃。(3)絲腺組織中類胡蘿卜素的

5、組成和含量比與繭絲基本一致。(4)絲腺組織對血液中類胡蘿素的吸收存在品種、時間和吸收部位上的差異。黃繭品種的絲腺組織主要吸收葉黃素，銹繭品種的絲腺組織主要吸收β-胡蘿卜素;黃繭品種幼蟲絲腺組織在末齡3天開始吸收葉黃素，紅繭品種03-320和銹繭品種03-520幼蟲的絲腺組織在末齡3大開始吸收β-胡蘿卜素，而在幼蟲末齡5天以后紅繭品種03-320才開始吸收葉黃素;紅繭品種03-320和銹繭品種03-520的中部絲腺后段主要吸收β-胡蘿卜素

6、，而紅繭品種中部絲腺中段主要吸收葉黃素。由此可知，血液中的類胡蘿卜素選擇性的進(jìn)入絲腺是黃紅繭系繭絲顏色出現(xiàn)品種差異的主要原因。
　　2.家蠶黃紅繭形成相關(guān)基因的發(fā)育時期表達(dá)模式與類胡蘿卜體內(nèi)積累的關(guān)系
　　采用RT-PCR方法，對不同繭色家蠶品種幼蟲末齡中腸和絲腺組織中CBP、Cameo2和SCRB15的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，CBP在黃繭、紅繭和銹繭品種的中腸和絲腺中均有表達(dá);Cameo2在黃繭品種和紅繭品種的中腸和絲腺以

7、及銹繭品種的中腸中均有表達(dá);SCRB15在黃繭、紅繭和銹繭品種的絲腺中有表達(dá)。通過實時定量PCR分析這3個基因在不同繭色家蠶品種幼蟲末齡1～7天中腸和絲腺組織中的發(fā)育時期表達(dá)模式，結(jié)果表明，Cameo2和SCRB15在絲腺中的發(fā)育時期表達(dá)模式分別與葉黃素和β-胡蘿卜素的積累規(guī)律一致。以上結(jié)果說明，CBP、Cameo2和SCRB15可能參與紅繭和銹繭繭絲顏色的形成。此外，CBP總是與Cameo2和/或SCRB15同時表達(dá)，預(yù)示CBP有可能

8、與Cameo2或SCRB15共同作用調(diào)節(jié)絲腺類胡蘿卜素的積累。
　　3.家蠶黃紅繭形成相關(guān)蛋白類胡蘿卜素轉(zhuǎn)運功能的初步研究
　　為了初步探索CBP、Cameo2和SCRB15在家蠶絲腺組織類胡蘿卜素積累過程中的具體作用，我們首先對這3個基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點進(jìn)行了在線預(yù)測。結(jié)果表明，CBP屬于StAR蛋白家族成員，沒有跨膜區(qū)。Cameo2和SCRB15均屬于CD36蛋白超家族成員，兩個蛋白在近N端和近C端各有一個跨膜區(qū)域。亞

9、細(xì)胞定位和共定位結(jié)果顯示，SCRB15和Cameo2可以定位在細(xì)胞的質(zhì)膜、內(nèi)囊泡膜和核膜上，而CBP定位在整個細(xì)胞，CBP和SCRB15或Cameo2能夠在同一部位重疊。以上結(jié)果說明SCRB15和Cameo2為膜蛋白，而CBP可能是胞質(zhì)蛋白。
　　轉(zhuǎn)染細(xì)胞類胡蘿卜素吸收實驗結(jié)果表明，表達(dá)SCRB15的細(xì)胞吸收β-胡蘿卜素的濃度是對照組的1.82倍，差異顯著(P＜0.05);表達(dá)SCRB15+CBP的細(xì)胞β-胡蘿卜素的濃度是對照組的

10、2.50倍(P＜0.01)，且與其他組合轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比差異均顯著（P＜0.05），說明SCRB15可提高轉(zhuǎn)染細(xì)胞對β-胡蘿卜素的吸收能力，CBP可與SCRB15協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞β-胡蘿卜素的吸收。采用含有不同類胡蘿卜素微膠粒的培養(yǎng)基孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果表明，表達(dá)SCRB15+CBP的細(xì)胞特異性吸收β-胡蘿卜素，而表達(dá)Cameo2+CBP的細(xì)胞特異性吸收葉黃素。表達(dá)SCRB15+CBP的細(xì)胞對β-胡蘿卜素的吸收具有時間、濃度依賴和飽和性，而表

11、達(dá)Cameo2+CBP的細(xì)胞對葉黃素的吸收也具有時間、濃度依賴性和飽和性，說明膜蛋白SCRB15和Cameo2可以分別選擇性識別和介導(dǎo)β-胡蘿卜素和葉黃素的細(xì)胞吸收。
　　BiFC分析結(jié)果表明:CBP和Cameo2或SCRB15在細(xì)胞內(nèi)存在物理位置上的相互靠近或直接的相互作用。
　　綜合以上結(jié)果，我們得出以下結(jié)論:在體外細(xì)胞培養(yǎng)體系中，膜蛋白SCRB15選擇性識別β-胡蘿卜素，而Cameo2則選擇性識別葉黃素，它們可能是通過

12、細(xì)胞內(nèi)陷形成囊泡的形式攜帶類胡蘿卜素進(jìn)入細(xì)胞，在此過程中分散在細(xì)胞質(zhì)中的CBP與SCRB15和Cameo2的胞質(zhì)部分相互作用，促進(jìn)囊泡的形成和細(xì)胞內(nèi)的運輸。
　　4.家蠶銹繭品種03-520絲腺組織類胡蘿卜素結(jié)合蛋白的分離純化與鑒定
　　為尋找新的類胡蘿卜轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)因子，我們以銹繭品種03-520絲腺組織為材料提取類胡蘿卜素結(jié)合蛋白。采用多種蛋白純化方法獲得了CBP、蛻皮激素氧化酶和視黃酸結(jié)合蛋白的純化樣品。其中CBP蛋白主要

13、結(jié)合葉黃素(71.14％)和β-胡蘿卜素(22.75％)。類胡蘿卜素-CBP復(fù)合物的光譜具有類胡蘿卜素吸收峰的特征，吸收波長分別為432 nm，462nm和492nm。視黃酸結(jié)合蛋白純化樣品的光譜也具有類胡蘿卜素吸收峰的特征，吸收波長分別為434nm，456nm和482nm。蛻皮激素氧化酶純化樣品的光譜雖不具有類胡蘿卜素的特征峰，但在可見光區(qū)有兩個光譜吸收峰，波長分別為399nm和466nm。我們首次在視黃酸結(jié)合蛋白和蛻皮激素氧化酶純化