家蠶雄蛾附腺的蛋白質(zhì)組分析及其特異基因的功能研究.pdf

1、家蠶是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的吐絲昆蟲，也是鱗翅目昆蟲研究的重要模式生物之一。家蠶有很強(qiáng)大的生殖潛力和繁衍后代的能力，通過交配活動(dòng)可以使雌性在生理和行為上發(fā)生一定的變化，而為這種交配后變化提供強(qiáng)大物質(zhì)基礎(chǔ)的是家蠶雄蛾附腺。家蠶雄蛾附腺可以分泌多種物質(zhì)，并且與由精巢產(chǎn)生的精子混合形成精液，對(duì)雌雄的生殖交配活動(dòng)產(chǎn)生一定的作用，這種作用是一個(gè)比較復(fù)雜的生物學(xué)過程，具體機(jī)理還不清楚。
　　目前對(duì)于家蠶雄蛾附腺的蛋白質(zhì)組成成分也不甚了解。鑒于

2、以上原因，本研究收集了家蠶雄蛾附腺，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)（LC-MS/MS技術(shù)）對(duì)附腺進(jìn)行了全蛋白質(zhì)組分鑒定，對(duì)所鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行GO聚類分析和功能分類，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已對(duì)附腺組織進(jìn)行的雙向電泳圖譜鑒定結(jié)果，篩選出候選基因BGIBMGA001815(BmAGSP3)和BGIBMGA014604(BmAGSP4)，進(jìn)行后續(xù)研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.家蠶雄蛾附腺的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　為了鑒定家蠶雄蛾附腺的蛋白質(zhì)組成，我們收集

3、了化蛾第1天的雄性附腺并提取了總蛋白質(zhì)，通過LC-MS/MS技術(shù)共鑒定到1657個(gè)蛋白質(zhì)，鑒定到的所有蛋白質(zhì)中，蛋白質(zhì)分子量主要介于10kDa～100kDa之間，等電點(diǎn)主要介于4～10之問。將鑒定到的雄蛾附腺蛋白質(zhì)與本實(shí)驗(yàn)室鑒定的雄蛾精巢蛋白質(zhì)進(jìn)行GO聚類分析比較，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)組織蛋白質(zhì)種類很相似，并且在附腺中有兩類特異的與能量代謝相關(guān)的蛋白:NAD或NADH結(jié)合類蛋白，氧化還原酶活性類蛋白。按照功能注釋對(duì)鑒定的附腺蛋白進(jìn)行功能分類，可分

4、為十類:生殖相關(guān)蛋白、發(fā)育進(jìn)化相關(guān)蛋白、能量代謝相關(guān)蛋白、分子伴侶相關(guān)蛋白、糖蛋白相關(guān)蛋白、免疫相關(guān)蛋白、蛋白酶抑制劑、蛋白酶、其他酶類和其他蛋白、功能未知蛋白。
　　2.BmAGSP3和BmAGSP4基因的克隆、原核表達(dá)和純化
　　基于家蠶雄蛾附腺的蛋白質(zhì)組成的LC-MS/MS數(shù)據(jù)，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室張利平等的雄蛾附腺組織雙向電泳圖譜分析，確定附腺特異表達(dá)的BmAGSP3和BmAGSP4兩個(gè)基因做為功能研究的候選基因。我們克隆

5、了BmAGSP3和BmAGSP4基因，構(gòu)建了p28-BmAGSP3和p28-BmAGSP4重組表達(dá)載體，進(jìn)行原核表達(dá)，利用鎳柱親和層析的方法純化重組蛋白，得到了純度較高的BmAGSP3和BmAGS4重組蛋白，并且制備多克隆抗體，為這兩個(gè)蛋白的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　3.BmAGSP3和BmAGSP4的表達(dá)特征分析及組織定位
　　利用RT-PCR和Western blotting的方法，分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平對(duì)BmA

6、GSP3和BmAGSP4進(jìn)行了表達(dá)特征分析，發(fā)現(xiàn)BmAGSP3，BmAGSP4在雄蛾第1天的附腺組織中特異高量表達(dá)。
　　利用制備的多克隆抗體，在雄蛾附腺組織中對(duì)BmAGSP3，BmAGSP4進(jìn)行免疫熒光定位，發(fā)現(xiàn)BmAGSP3在附腺中的表達(dá)量很少，而BmAGSP4在附腺中的表達(dá)量較多，并且這兩個(gè)蛋白都存在于雄蛾附腺管腔細(xì)胞的胞質(zhì)中和附腺管腔內(nèi)，因此推測(cè)這兩個(gè)蛋白都是由附腺細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到管腔中。
　　4.BmAGSP4的功

7、能研究
　　利用制備的多克隆抗體，我們檢測(cè)了家蠶雌雄交配活動(dòng)后BmAGSP3和BmAGSP4兩種蛋白進(jìn)入雌蛾體內(nèi)的情況，在交配后的雌蛾生殖系統(tǒng)內(nèi)只檢測(cè)到了BmAGSP4，但BmAGSP4被降解為若干條分子量大小不同的蛋白。
　　基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們對(duì)BmAGSP4進(jìn)行了RNA干涉實(shí)驗(yàn)，將干涉后的雄蛾與正常雌蛾進(jìn)行交配，交配后讓雌蛾正常產(chǎn)卵，再對(duì)產(chǎn)卵數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示干涉BmAGSP4后，雌蛾的產(chǎn)卵數(shù)與對(duì)照組相比有顯著降低