蛋白質(zhì)組分析條件的優(yōu)化與弱精癥患者精液比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的:優(yōu)化基于MALDI-TOF-MS的蛋白質(zhì)組分析條件，研究弱精癥患者與正常生殖能力者精液中精子和精漿蛋白質(zhì)表達差異，探討弱精不育機制。 方法:在優(yōu)化蛋白質(zhì)組分析條件時，選取對蛋白組研究結(jié)果有較大影響的MALDI-TOF-MS分析條件、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度、搜索引擎采用、數(shù)據(jù)庫選擇以及主要參數(shù)設(shè)置進行考察，用BSA數(shù)據(jù)來建立標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)模型，以CAH2_BOVIN、Hsp70s數(shù)據(jù)為訓(xùn)練對象檢驗標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，最后獲得優(yōu)化的蛋白質(zhì)分析條件。

2、 在弱精癥患者精液比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，收集臨床上確認(rèn)的弱精癥精液樣本，分別制備精子和精漿；采用2-DE分離/銀染檢測差異表達蛋白策略進行圖譜分析，對差異表達蛋白以胰蛋白酶(trypsin)酶解，肽段混合物經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定獲得PMF數(shù)據(jù)，MS-Fit數(shù)據(jù)庫搜索，最終獲得有關(guān)蛋白質(zhì)的信息。 結(jié)果： 1、以BSA質(zhì)譜數(shù)據(jù)為研究對象，考察了經(jīng)MALDI-TOF-MS獲得PMF時分析條件及準(zhǔn)確度對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索

3、結(jié)果的影響。 2、以CAH2_BOVIN質(zhì)譜數(shù)據(jù)為訓(xùn)練集建立模型，然后以人Hsp70s數(shù)據(jù)進行檢驗，優(yōu)化了PMF鑒定蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析條件。 3、以弱精患者精子/精漿為研究對象，在不同的條件下進行2-DE，獲得了較高分辨率的凝膠圖譜，同時分離得到的蛋白質(zhì)點滿足了質(zhì)譜分析的要求。 4、弱精患者組與正常組精子的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究：與正常組比較，從弱精患者組精子樣本中發(fā)現(xiàn)高度表達而正常樣本中缺失或表達下調(diào)的27個蛋白點以及

4、在正常精子中存在而在弱精不育精子中缺失或低表達的37個點，經(jīng)PMF鑒定和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索，初步找到了47相關(guān)蛋白質(zhì)。 5、弱精患者組與正常組精漿的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究：從正常組樣本中發(fā)現(xiàn)24個蛋白點高表達(3個在不育缺失)，18個蛋白點在不育高表達(3個蛋白點在正常缺失)，經(jīng)肽質(zhì)量指紋譜鑒定和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索獲得36個蛋白相關(guān)信息，并對EDH1、PSMA、KCL1和CDC25A等蛋白進行了Western blot確認(rèn)。 結(jié)

5、論 MALDI-TOF-MS的離子化是一種由基質(zhì)介導(dǎo)的、復(fù)雜的固相/氣相過程，分析條件的選擇對后續(xù)蛋白質(zhì)搜索結(jié)果的影響十分明顯，合適的分析條件可以給實驗結(jié)果帶來高可信度。要獲得正確的PMF必須高度重視質(zhì)譜分析條件的選擇與優(yōu)化。質(zhì)譜分析參數(shù)的選擇包括質(zhì)譜精確度的控制、激光強度的選擇、加速電壓的設(shè)定、延遲時間和激光擊打次數(shù)的選擇等。 與經(jīng)典的蛋白質(zhì)研究不同，在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究工作中，是通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的比對來獲得鑒

6、定結(jié)果的，如果所獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)有誤差，或與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對時的參數(shù)設(shè)置不合理，將對搜索結(jié)果產(chǎn)生很大的影響。本研究的結(jié)果表明，Swissprot最適合于做PMF搜索的數(shù)據(jù)庫；從搜索引擎來說，通過兩個引擎進行搜索是較為合理的，這樣可避免漏檢和降低候選蛋白的誤選幾率；對漏切位點、質(zhì)量容錯數(shù)等參數(shù)的選擇應(yīng)根據(jù)研究要求進行優(yōu)化。弱精患者的精子蛋白質(zhì)組對應(yīng)于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄、合成、轉(zhuǎn)換、轉(zhuǎn)運等環(huán)節(jié)，均出現(xiàn)了相關(guān)功能蛋白的上調(diào)或下調(diào)。精漿蛋白質(zhì)組的差異表