不同倍性及親子代泥鰍的DNA甲基化差異分析.pdf

1、為探討不同倍性及親子代泥鰍基因組DNA的甲基化水平及模式差異，本研究以自然多倍體（二倍體、三倍體和四倍體）及親子代（四倍體♀×二倍體♂）泥鰍為研究對(duì)象,利用正交實(shí)驗(yàn)建立了泥鰍甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(Methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP)方法的反應(yīng)體系。并利用該方法對(duì)其基因組DNA甲基化水平與模式進(jìn)行了MSAP分析。結(jié)果表明：
　?。?）泥鰍MSAP技術(shù)反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

2、
　　本研究優(yōu)化并建立最佳泥鰍 MSAP反應(yīng)體系，包括800 ng的泥鰍基因組 DNA，用EcoR I，Hpa II和Msp I各10 U，在37℃8 h后即可酶切；最佳的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系是預(yù)擴(kuò)增引物0.8μL、dNTPs0.2 mmol/L、Mg2+1.5 mmol/L和Taq1 U；最佳的選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系是預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍DNA2μL、引物1.5μL、 dNTPs0.375 mmol/L、 Mg2+1.5 mmol/L和T

3、aq1 U。該體系穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，為 MSAP技術(shù)在泥鰍相關(guān)研究中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　?。?）不同倍性泥鰍基因組DNA甲基化的水平及模式差異分析。
　　本研究選用自然二倍體、自然三倍體和自然四倍體泥鰍為研究對(duì)象，在25對(duì)選擇性擴(kuò)增引物組合中選出6對(duì)引物，共獲得1431個(gè)位點(diǎn)。對(duì)比分析甲基化水平及模式發(fā)現(xiàn)，二倍體、三倍體及四倍體總甲基化率分別是39.98％、33.72%和32.36%。分析這些位點(diǎn)的甲基化模式表明：甲基

4、化模式在三個(gè)倍性間類型相同占所檢測(cè)位點(diǎn)的24.1%，僅兩種倍性相同的為60.9%，各不相同的為15.1%。比較泥鰍多倍體間相同的甲基化帶型模式，二倍體與三倍體相同的甲基化模式率為38.6%，二倍體與四倍體相同的甲基化模式率為41.8%。表明在染色體加倍的過程中，總甲基化率隨著染色體的加倍而降低，三者之間甲基化模式的差異表達(dá)并未發(fā)生很大變化，但兩兩之間卻存在較大差異，與三倍體相比，四倍體的甲基化模式與二倍體更加接近。
　?。?）親子

5、代泥鰍基因組DNA甲基化的水平與模式分析
　　以自然四倍體泥鰍為母本、自然二倍體泥鰍為父本及其后代雜交三倍體（1齡）泥鰍為研究對(duì)象，在25對(duì)選擇性擴(kuò)增引物組合中選出6對(duì)引物，對(duì)比分析甲基化水平及模式發(fā)現(xiàn)，父本、母本及其 F1代的CCGG位點(diǎn)中，總甲基化率分別是38.27%，24.21%及27.21%。分析這些位點(diǎn)的甲基化模式表明：雜交過程中甲基化模式進(jìn)行了大量的調(diào)整，包括單態(tài)性位點(diǎn)(A型），480個(gè)（29.0%）；去甲基化類型(B

6、型），285個(gè)（17.2%）；過或超甲基化類型（C型），628個(gè)（37.9%）；次甲基化類型（D型），263個(gè)（15.9%）。研究表明，在雜交過程中，子代的甲基化水平介于雙親之間，子代存在的特異模式所占比例較低，從親本到子代的傳遞過程主要以過或超甲基化為主。
　　綜上所述，在泥鰍多倍化與雜交的過程中發(fā)生了一定程度的基因組 DNA甲基化水平及模式的改變，本文從分子生物學(xué)的角度進(jìn)行系統(tǒng)研究，旨在探索多倍化及雜交過程的表觀遺傳機(jī)理，為我