錦鯉紅白皮體色表達(dá)譜分析及相關(guān)基因甲基化表達(dá)模式的研究.pdf

1、錦鯉（Cyprinus carpio var. Koi)，隸屬鯉科，是鯉魚的一個(gè)變種，因其體色變化豐富多彩，變幻多姿，是一種全球范圍內(nèi)重要的觀賞魚類。其中，紅白錦鯉為最常見品種，本文主要以紅白錦鯉作為主要的研究材料，研究體色差異的分子機(jī)制，本文通過RNA-Seq技術(shù)對(duì)紅白錦鯉的紅皮和白皮兩個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究，得到的結(jié)果如下：
　　1.采用雙端100 nt Illumina Hiseq測序，在紅皮與白皮樣本中分別得到1.03千萬

2、條雙末端序列，以已發(fā)布的鯉魚基因組做參考，由Cufflinks對(duì)測序reads進(jìn)行比對(duì)、組裝和整合，共得到85,823條組裝后的轉(zhuǎn)錄本，其中81,959（95.3％）條轉(zhuǎn)錄本能夠比對(duì)到參考基因組中，剩余3,846條轉(zhuǎn)錄本在基因組的覆蓋區(qū)域與參考注釋轉(zhuǎn)錄本不一致，這些轉(zhuǎn)錄本來自3,157個(gè)不同的基因區(qū)域，其中437個(gè)比對(duì)到外顯子反義鏈上的基因，2,720個(gè)比對(duì)到基因間隔區(qū)域。
　　2.未比對(duì)到參考基因組的3,157個(gè)基因用Trans

3、coder以及BLASTX進(jìn)行預(yù)測和比對(duì)，預(yù)測到2,295潛在編碼蛋白的基因，剩余的862個(gè)基因與ENSEMBL中硬骨魚ncRNA數(shù)據(jù)庫以及 NONCODE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 BLASTN比對(duì)，共有143個(gè)基因找到同源的已知ncRNA。
　　3.用Cuffdiff、DESeq和edgeR根據(jù)比對(duì)后所得FPKM值，對(duì)轉(zhuǎn)錄本在紅皮與白皮中的表達(dá)量差異進(jìn)行分析，分別得到169，453，1453個(gè)差異基因，共同的差異基因?yàn)?2個(gè)，其中52個(gè)在紅皮

4、與白皮中都表達(dá)，但表達(dá)存在差異，有2個(gè)在紅皮特異表達(dá)，8個(gè)在白皮中特異表達(dá)。通過qRT-PCR對(duì)52個(gè)差異基因在紅皮與白皮中的表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示有3個(gè)基因表達(dá)模式與RNA-Seq不一致，有3個(gè)基因表達(dá)不顯著，有46個(gè)基因表達(dá)與RNA-Seq結(jié)果一致且在紅皮與白皮中的表達(dá)差異顯著。
　　4.對(duì)差異基因用BS-PCR法進(jìn)行甲基化分析，其中錦鯉的gpib基因與klf4a基因甲基化存在差異，gpib在紅皮中甲基化較高為83.98%

5、，在白皮中為68.68%；klf4a在白皮中的甲基化程度較高為95.8%，在紅皮中的甲基化程度為79.8%，這與 RNA-Seq結(jié)果和qRT-PCR結(jié)果成反比，說明甲基化可能參與基因的表達(dá)調(diào)控。
　　在本研究中，使用RNA-Seq技術(shù)得到錦鯉紅白皮膚的轉(zhuǎn)錄組序列，得到其體色的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并對(duì)紅白體色中表達(dá)差異的基因進(jìn)行注釋和表達(dá)量驗(yàn)證，得到了紅白皮差異基因表達(dá)譜，對(duì)其中兩個(gè)差異基因可能的甲基化修飾進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)分析，探究其表觀遺傳機(jī)制