香鱗毛蕨4CL基因家族的克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、香鱗毛蕨是多年生藥用真蕨類(lèi)植物，在我國(guó)以黑龍江省為分布中心，特別是五大連池地區(qū)分布面積較大。由于其獨(dú)特的生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)特點(diǎn)賦予了香鱗毛蕨獨(dú)特的藥用價(jià)值。香鱗毛蕨作為民間用藥，主要用于治療關(guān)節(jié)炎和各種皮膚病，包括銀屑病、痤瘡、皮疹和皮炎等，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，香鱗毛蕨還具有較強(qiáng)的驅(qū)蟲(chóng)、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗病毒等多重作用。迄今為止，一些研究人員主要在形態(tài)解剖學(xué)觀(guān)察、化學(xué)成分的提取分離及藥理活性等方面對(duì)香鱗毛蕨進(jìn)行研究，關(guān)于香鱗毛蕨中次生

2、代謝途徑相關(guān)酶基因的研究進(jìn)行的較少。因此，模擬香鱗毛蕨特殊生境的溫光處理對(duì)香鱗毛蕨有效成分的積累，并從分子角度闡明其調(diào)控機(jī)制，為實(shí)現(xiàn)我國(guó)野生香鱗毛蕨資源的有效保護(hù)和有效成分的可持續(xù)利用提供理論依據(jù)，應(yīng)用前景十分廣闊。
　　在植物體中，包括木質(zhì)素和黃酮類(lèi)化合物等次級(jí)代謝產(chǎn)物都是由苯丙烷類(lèi)代謝途徑產(chǎn)生的，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物不但對(duì)植物體自身具有重要的作用，而且對(duì)人體的健康具有重要作用，因此，苯丙烷代謝途徑及途徑中的關(guān)鍵酶成為人們研究的熱點(diǎn)

3、。在這條代謝途徑中，4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)位于主途徑向分支途徑過(guò)渡的關(guān)鍵點(diǎn)上，控制進(jìn)入不同的苯丙烷類(lèi)化合物代謝支路，產(chǎn)生不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物，并且研究發(fā)現(xiàn)4CL基因?qū)倩蚣易逍问?，不同?CL基因可控制代謝途徑的不同方向，研究4CL基因家族成員對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物調(diào)控及次級(jí)代謝物質(zhì)的積累有重要意義，也為廣泛研究及應(yīng)用香鱗毛蕨的次級(jí)代謝產(chǎn)物打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　本試驗(yàn)在前期的溫光誘導(dǎo)香鱗毛蕨轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序的研究中，確定苯丙烷類(lèi)衍生物代

4、謝途徑是香鱗毛蕨黃酮類(lèi)化合物的重要代謝途徑，這與被子植物的苯丙烷類(lèi)代謝較為相似。其中，4-香豆酸輔酶A連接酶基因則是這個(gè)代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因。目前，4CL基因在被子植物、裸子植物、苔蘚植物已經(jīng)被廣泛的研究，而對(duì)于蕨類(lèi)植物中則鮮有報(bào)道。本研究結(jié)合本課題組對(duì)香鱗毛蕨轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的分析，從中篩選出4-香豆酸輔酶A連接酶基因，得到的主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.本研究通過(guò)從本組前期試驗(yàn)獲得溫光處理的香鱗毛蕨轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中篩選并選定Unig

5、ene15437_All，Unigene18514_All，Unigene21777_All Unigene32945_All4條基因，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，4個(gè)基因與已知植物4CL基因具有高度同源性，并以此為核心片段，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　2.本文中通過(guò)RACE技術(shù)，將獲得的4個(gè)核心片段進(jìn)行全長(zhǎng)的序列擴(kuò)增，獲得4個(gè)全長(zhǎng)基因，并將Unigene15437_All，Unigene18514_All，Unigene21777_All Uni

6、gene32945_All命名為Df4CL1、Df4CL2、Df4CL3、Df4CL4。進(jìn)一步研究這四個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)都具有兩個(gè)功能保守域BoxⅠ(SSGTTGLPKGV)和BoxⅡ(GEICIRG)及底物結(jié)合區(qū)SbdⅠ和SbdⅡ，并與公開(kāi)發(fā)表的其他植物中的4CL基因具有高度的一致性。這4個(gè)基因之間的一致性為66.00％，編碼分別539、565、552和573個(gè)氨基酸，4個(gè)基因推測(cè)的氨基酸序列之間的一致性為56.59％。確定這4個(gè)基因?yàn)?-

7、香豆酸輔酶A連接酶基因，并確定為一個(gè)基因家族。
　　3.本文運(yùn)用CHIPS、 CUSP和CodonW在線(xiàn)程序?qū)ψ灾骺寺〉南泖[毛蕨4CL基因(Df4CL)序列進(jìn)行分析，并與大腸桿菌、酵母菌、擬南芥、煙草等基因進(jìn)行比較，對(duì)了解Df4CL基因密碼子使用特性，為其選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，香鱗毛蕨4CL基因?qū)TGC選擇沒(méi)有偏向性，并且與小立碗蘚的密碼子使用偏好性相一致。在密碼子使用頻率上，Df4CL基因與擬南芥的差異小于

8、與煙草、大腸桿菌、酵母的差異;基于4CL基因的密碼子使用偏性的系統(tǒng)聚類(lèi)分析表明，香鱗毛蕨與小立碗蘚、擬南芥聚為一類(lèi)，因此預(yù)示香鱗毛蕨4CL基因更適合在擬南芥中外源表達(dá)。
　　4.通過(guò)在線(xiàn)軟件等生物信息學(xué)方法和手段分析香鱗毛蕨4CL蛋白的情況，研究發(fā)現(xiàn)，香鱗毛蕨4CL的4個(gè)蛋白均屬于兩性蛋白質(zhì)，DF4CL2蛋白無(wú)跨膜區(qū)，DF4CL1、DF4CL3和DF4CL4蛋白有兩個(gè)跨膜區(qū)，4個(gè)蛋白均無(wú)信號(hào)肽，并預(yù)測(cè)了4CL蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)，為今后

9、對(duì)該蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和可能的酶催化機(jī)制、與底物結(jié)合位點(diǎn)等相關(guān)研究提供重要理論基礎(chǔ)。
　　5.香鱗毛蕨Df4CLs基因組織表達(dá)與總黃酮和總木質(zhì)素含量之間基本正相關(guān)，在基因表達(dá)量高的組織中總黃酮和總木質(zhì)素含量也較高，這說(shuō)明從香鱗毛蕨中擴(kuò)增出來(lái)的基因Df4CLs參與總黃酮和總木質(zhì)素含量的合成。
　　6.香鱗毛蕨4CL基因的表達(dá)還能被溫度激活。在低溫(4℃)或者高溫(35℃)條件下，4個(gè)基因都表現(xiàn)為先增大后減少的趨勢(shì)，而香鱗毛蕨中黃

10、酮類(lèi)化合物含量和木質(zhì)素含量變化趨勢(shì)與之基本一致，但峰值點(diǎn)不相同，一般而言，黃酮類(lèi)化合物和總木質(zhì)素含量達(dá)到最高點(diǎn)的峰值要比基因滯后，溫度除影響基因的表達(dá)量外，還可能影響物質(zhì)合成中酶的活性，導(dǎo)致含量的變化。
　　7.紫外線(xiàn)照射同樣會(huì)影響4CL基因及黃酮含量和木質(zhì)素含量。在紫外線(xiàn)照射下，基因Df4CL3和Df4CL4顯著增加，尤其是Df4CL3。而黃酮類(lèi)化合物增加顯著，木質(zhì)素增加平緩。一般而言，在紫外線(xiàn)照射下，保護(hù)植物體防止紫外線(xiàn)輻射的

11、黃酮類(lèi)物質(zhì)會(huì)顯著增加，這與我們得到的試驗(yàn)結(jié)果也相一致。
　　8.本文成功構(gòu)建了Df4CL2的原核表達(dá)體系表達(dá)出具有酶活性的重組蛋白，通過(guò)表達(dá)載體pET28a-Df4CL2中的HIS標(biāo)簽成功純化出重組蛋白。
　　9.本文成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121-Df4CL1，通過(guò)浸花法對(duì)擬南芥野生型植株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。利用PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，獲得純合體轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)黃酮化合物和木質(zhì)素含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中的