金絲小棗和無核小棗4CL基因的克隆和表達(dá)研究.pdf

1、棗(Ziziphus jujuba Mill.)為鼠李科(Rhamnaceae)，棗屬(Ziziphus Mill.)植物，是我國特有的果樹資源和獨(dú)具特色的優(yōu)勢果樹樹種，是我國當(dāng)今第一大干果。無核小棗是一種天然存在的罕見無核果實(shí)品種。目前無核棗無核性狀形成機(jī)理尚無定論。無核小棗除果實(shí)無核外，其枝葉形態(tài)和花果特點(diǎn)與金絲小棗基本相同。本研究以金絲小棗和無核小棗為試材，從影響核層木質(zhì)化的相關(guān)基因方向，探討無核小棗無核性狀形成機(jī)理。主要研究結(jié)果

2、如下:
　　1.通過定期去河北滄縣棗良種繁育基地拍照、采樣，對果實(shí)縱橫徑、單果重及果形指數(shù)進(jìn)行測量，分析發(fā)現(xiàn)金絲小棗與無核小棗縱橫徑、單果重和果形指數(shù)發(fā)育趨勢基本相似，從花后5d到25d果實(shí)處于緩慢增長期，從花后30d左右開始果實(shí)縱橫徑迅速增長，到花后45d左右增長趨于平緩。單果重從20d增長明顯，從花后30d開始呈指數(shù)增長趨勢，隨著糖類等物質(zhì)的不斷積累果實(shí)的重量不斷增加。
　　2.通過基因克隆得到金絲小棗4CL基因1820

3、bp的eDNA序列，包含1776bp的完整開放閱讀框，編碼591個(gè)氨基酸殘基，登錄號為KP893564。該蛋白的相對分子質(zhì)量為63.726KDa，理論等電點(diǎn)為5.37。通過序列比對和結(jié)構(gòu)域分析，該基因具有多個(gè)活性位點(diǎn)、Amp結(jié)合位點(diǎn)、推定的COA結(jié)合位點(diǎn)和AAE consensus motif,同時(shí)含有4CL超基因家族的BoxⅠ和BoxⅡ兩個(gè)保守框，屬于4CL基因中AFD-Class-Ⅰ家族的新成員。該基因二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲為主，

4、預(yù)測了其三級結(jié)構(gòu)。NCBI比對結(jié)果顯示金絲小棗4CL基因與蘋果（Malus domestica XP_008362825）屬于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近，蛋白序列相似度為82％。
　　3.無核小棗4CL基因cDNA序列片段1819bp，包含1776bp的完整開放閱讀框，編碼591個(gè)氨基酸殘基，登錄號為KP279930。該蛋白的相對分子質(zhì)量為63.798kDa，理論等電點(diǎn)為5.31。通過ExPASy網(wǎng)站分析無核小棗的4CL蛋白具有多

5、個(gè)活性位點(diǎn)、Amp結(jié)合位點(diǎn)、推定的COA結(jié)合位點(diǎn)和AAE consensus motif,并含有4CL超基因家族的兩個(gè)保守框:BoxⅠ和BoxⅡ，屬于4CL基因中AFD-Class-Ⅰ家族的新成員。無核小棗4CL的二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲為主。NCBI比對結(jié)果顯示，該基因與蘋果(Malus domestica XP_008362825)親緣關(guān)系最近，蛋白序列相似度為82％，屬于同一進(jìn)化分支。
　　4.通過NCBI在線比對，無核小棗

6、與金絲小棗的核苷酸序列和蛋白序列相似度為99％。理化性質(zhì)和蛋白二、三級結(jié)構(gòu)的分析顯示其相似度非常高，但金絲小棗與無核小棗的基因序列有13個(gè)核苷酸之差，而蛋白序列有6個(gè)氨基酸之差。
　　5.應(yīng)用BioEdit軟件從棗基因組序列中搜尋到4CL基因的基因組序列，與克隆所得的金絲小棗和無核小棗的CDS區(qū)進(jìn)行比對結(jié)果顯示，CDS區(qū)中從1507到1651之間的145bp在基因組序列中并沒有找到。以金絲小棗為試材，通過基因克隆得到該段基因組序列

7、。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)該基因組包含個(gè)6外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。
　　6.以ZjH3基因?yàn)閮?nèi)參基因，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對不同發(fā)育時(shí)期無核小棗和金絲小棗的4CL基因表達(dá)特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明:4CL基因在金絲小棗和無核小棗果實(shí)的不同發(fā)育期表達(dá)有很大的差異。在金絲小棗和無核小棗中從花期開始一直呈上升表達(dá)的趨勢，到花后30d左右達(dá)到最大值，以后表達(dá)水平明顯下降，基本停止表達(dá)。且無核小棗表達(dá)量明顯低于金絲小棗，說明4CL基因是無核小棗果實(shí)無核性狀