松材線蟲的分子生物學(xué)鑒定方法與系統(tǒng)發(fā)育研究.pdf

1、松樹萎蔫病自上世紀(jì)以來一直是林業(yè)上的毀滅性病害。一般認(rèn)為，松樹萎蔫病的病原微生物為松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)。由于目前對(duì)于松材線蟲的防治尚無經(jīng)濟(jì)有效的措施，嚴(yán)格檢驗(yàn)檢疫是阻止該病的發(fā)生、傳播和蔓延最重要的途徑之一。由于擬松材線蟲(Bursaphelenchusmucronatus)具有和松材線蟲極其相似的外形特征，而難以將這兩種線蟲區(qū)分，針對(duì)這個(gè)問題，本文對(duì)這兩種線蟲的形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)的鑒定方法進(jìn)

2、行比較研究，以便找出一種準(zhǔn)確、便捷的檢驗(yàn)檢疫方法。 本研究分別收集了不同來源的40種松材線蟲和擬松材線蟲，并進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定。雖然兩種群之間根據(jù)雌蟲的尾尖突的不同可以將其粗略區(qū)分開來，但由于這一特征的不穩(wěn)定性，并不能將兩種線蟲準(zhǔn)確的區(qū)分。 在ITS-RFLP(Restrictionfragmentlengthpolymorphisim)研究中，首先探討了線蟲DNA的最佳提取方法，確認(rèn)采用SDS法提取線蟲基因組DNA，并以

3、ITS區(qū)特異性引物分別對(duì)松材線蟲和擬松材線蟲擴(kuò)增，均獲得了950bp左右的擴(kuò)增片段。進(jìn)一步利用AluⅠ，HinfⅠ，MspⅠ，HaeⅢ和RsaⅠ五種內(nèi)切酶分別對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果表明，五種酶的任何一種都能區(qū)分松材線蟲和擬松材線蟲，而內(nèi)切酶HaeⅢ，RsaⅠ還能準(zhǔn)確區(qū)分亞洲型和歐洲型的擬松材線蟲群體。 此外，本文還利用6種不同的隨機(jī)引物，通過RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)技術(shù)對(duì)松材線

4、蟲和擬松材線蟲的基因組DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，以探討區(qū)分種間及種內(nèi)群體的親緣關(guān)系的簡便方法，結(jié)果顯示：利用OPB07和OPX01為隨機(jī)引物，RAPD法可以明顯區(qū)分松材線蟲和擬松材線蟲并與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相吻合；以O(shè)PY01為隨機(jī)引物擴(kuò)增后進(jìn)行聚類分析的結(jié)果也表明，線蟲種內(nèi)和種間均存在差異，同種線蟲在同一地區(qū)或臨近地區(qū)的同源性明顯高于其它地區(qū)，而同一地區(qū)內(nèi)寄主對(duì)線蟲同源性的影響較小。另外，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究結(jié)果顯示出我國松材線蟲和北美松材線蟲群