抗水稻紋枯病細菌拮抗物質(zhì)及菌株基因突變的研究.pdf

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文抗水稻紋枯病細菌拮抗物質(zhì)及菌株基因突變的研究姓名：何青芳申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：陳衛(wèi)良2002.5.1* Ⅱ^ 掌m ±掌m * X抗水稻紋枯病細菌拮抗物質(zhì)及菌株基因突變的研究摘要拮抗細菌菌株B a c i l l u s s u b t i l i s A 3 0 分離自水稻葉圍。平皿測試表明B a c i l l u ss u b t i l i s A 3 0 對多種植物病原菌，如

2、病原真菌水稻紋桔病菌( R h i z o c t o n i as o l a n i ) 、稻瘟病菌( M a g n a p o r ／h eg r i s e a ) 等，病原細菌稻白葉枯病菌( X a n t h o m o n a s o r y z a e p v ．o r y z a e ) 等有強烈抑制作用。對該菌株的生長曲線及活性曲線進行分析，可知當(dāng)細菌生長到對數(shù)生長中期時( O D 6 0 0 約為3 ．5 ) ，

3、拮抗活性丌始被檢測出：在細菌生長進入穩(wěn)定生長期后，拮抗活性達到最大，隨后趨于穩(wěn)定。／—< 將拮抗菌A 3 0 菌株接種于L B 液體培養(yǎng)基中，3 T C 下培養(yǎng)2 6 小時，然后8 0 0 訟- p m 離心2 0 m i n 去菌體，所得的去菌培養(yǎng)液用4 0 ％的硫酸銨沉淀過夜后1 2 0 0 0 r p m 離心2 0 m i n 。將得到的沉淀用磷酸緩沖液懸浮，懸浮液離心去雜后通過F P L C 疏水色譜和H P L C 反

4、相色譜進行分離純化，最后純化得到一種拈抗物質(zhì)P 1 。經(jīng)L C ．E S I ．M S 質(zhì)譜初步判斷其分子量為1 4 7 6 ．7 D a 。P I 物質(zhì)經(jīng)酸處理后活性有部分降低，對堿穩(wěn)定：經(jīng)1 2 0 。C 高溫處理3 0 r a i n 仍保持活性；同時該物質(zhì)對蛋白酶K 和胰蛋白酶以及乙醇、異丙醇、乙腈等有機溶劑具有穩(wěn)定性。另外，P l 的茚三酮反應(yīng)為陰性，但經(jīng)酸水解后，茚三酮反應(yīng)和雙縮脲反應(yīng)呈陽性。根據(jù)以上結(jié)果推測它可能為?種環(huán)肽

5、，或者為含有非氨基酸組分的肽類化合物。但拮抗菌A 3 0 菌株去菌培養(yǎng)液經(jīng)4 0 ％的硫酸銨沉淀后所得的懸浮液通過3 0 K D a 分子量截流管截流試驗發(fā)現(xiàn)，拮抗物質(zhì)可被截流管截流，由此分析其分子量應(yīng)大于3 0 K D a ，這可能是因為拮抗物質(zhì)與某種大分子結(jié)合造成的。用含T n 9 1 7 轉(zhuǎn)座子的p T V I - O K 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化A 3 0 菌株感受態(tài)細胞，在紅霉素和卡那霉素雙抗培養(yǎng)基上篩選獲得6 個轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒檢測發(fā)現(xiàn)這六株