番茄葉綠體抗氧化酶基因的克隆與遺傳轉化的研究.pdf

1、山東農業(yè)大學碩士學位論文番茄葉綠體抗氧化酶基因的克隆與遺傳轉化的研究姓名：王偉青申請學位級別：碩士專業(yè)：植物學指導教師：孟慶偉2003.6.1山東農業(yè)大學碩士學位論文摘 要植物體內產生的活性氧能被超氧化物歧化酶( S O D ) 、抗壞血酸過氧化物酶( A P X ) 等抗氧化酶清除。超氧陰離子自由基在S O D 的催化下，通過歧化反應產生H 2 0 2 ?？箟难徇^氧化物酶( A P X ) 是一種清除H 2 0 2的關鍵酶，它對于保

2、護葉綠體和其它細胞組分免受H 2 0 2 及其所產生的羥基自由基的破壞是必不可少的。本文以抗冷性不同的兩個番茄品種( 系) 為試材，測定了低溫脅迫下抗氧化酶活性，克隆了番茄葉綠體A P X 和C u ／Z n —S O D 基因，并轉化煙草，的活性影響。在低溫處理的最初4h ，番茄葉片的S O D 、A P X 、P O D活性均上升。S O D 、A P X 、C A T 活性分別在處理的6 h 、6 h 、2h 時達到峰值，然后下降

3、。在低溫脅迫初期，抗冷性較強的番茄品種L 4 0 2的酶活性上升速度明顯快于中雜7 號，而達峰值后酶活性的下降明顯慢于中雜7 號。P O D 活性則隨低溫處理時間延長而持續(xù)增強。2 ．根據其它植物已知的類囊體膜A P X 的氨基酸保守序列設計兼并引物，以抗冷性較強的L 4 0 2 低溫處理6 h 的葉片為材料，利用R T —P C R 法得到了一個約4 0 5 b p 的基因片段。經測序和B L A S T 分析表明，該片段與其它植物類

4、囊體膜A P X 基因具有較高的同源性，是番茄類囊體膜A P X 基因片段，并在G e n e B a n k 登記( A F 4 1 3 5 7 3 ) 。3 ．根據獲得序列設計引物進行3 ’和5 ’R A C E ．P C R ，并進一步獲得番茄類囊體膜A P X 基因的全長。4 ．從低溫處理6h 的番茄品種L 4 0 2 的葉片中提取總R N A ，用R T ．P C R的方法擴增C u ／Z n ．S O D 的c D N A

5、，所克隆的C u ／Z n ．S O D c D N A 序列全長為9 6 2 b p ，編碼2 1 7 個氨基酸。用G e n B a n k 中的B L A S T 進行序列分析，該序列與菠菜、豌豆、擬南芥C u ／Z n ．S O D 的同源性分別是8 2 ％、8 2 ％、8 0 ％。說明已經獲得了番茄品種L 4 0 2 的葉綠體C u ／Z n —S O D 序列，并在G e n B a n k 注冊( A F 5 2 7 8