苜蓿中華根瘤菌與耐鹽有關(guān)基因的克隆和功能分析.pdf

1、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042B分離自新疆的和田苜蓿,能夠在含0.6mol/L NaCl的FY基本培養(yǎng)基中生長.經(jīng)Tn5-1063誘變得到042B的轉(zhuǎn)座子插入突變體,從3000多株突變株中得到5株鹽敏感變株042BL-1、042BL-2、042BL-3、042BL-4和042BL-5.耐鹽性試驗(yàn)表明,它們都不能在含有0.4mol/L NaCl的FY培養(yǎng)基中生長.其中,042BL-4在含有0.3mol

2、/L NaCl的FY培養(yǎng)基上不能生長,042BL-5在含有0.2mol/L NaCl的FY培養(yǎng)基上不能生長.5株鹽敏感突變株對于LiCl、KCl和蔗糖都有不同程度的敏感,并能夠在苜蓿上結(jié)瘤固氮.以轉(zhuǎn)座子內(nèi)的基因luxAB為探針進(jìn)行Southern雜交,發(fā)現(xiàn)Tn5在這5個突變株中都只有單一拷貝的插入,表明突變株的耐鹽表型改變是由于轉(zhuǎn)座子插入誘變造成的.使用轉(zhuǎn)座子挽救法克隆了042BL-2中Tn5插入側(cè)翼的序列.提取042BL-2的基因組D

3、NA,經(jīng)ClaI完全酶切后,與luxAB探針雜交得到12kb左右的陽性條帶.回收12kb的ClaI片段,以pBBR1MCS-2為載體,構(gòu)建含有轉(zhuǎn)座子及側(cè)翼序列的部分基因文庫.通過菌落PCR篩造出陽性克隆,經(jīng)Southern雜交驗(yàn)證后,以Tn5兩端已知的序列設(shè)計引物進(jìn)行測序.測序結(jié)果表明,042BL-2中Tn5插入定位在染色體上,位于smc00190基因中.其功能未知,該實(shí)驗(yàn)證明它與耐鹽有關(guān),命名為rstC基因.RstC蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明

4、,此蛋白是一個具有兩個跨膜區(qū)的跨膜蛋白,在C末端有兩個卷曲螺旋,N末端在壁膜間隙形成一個環(huán),這些結(jié)構(gòu)與細(xì)菌趨化作用中的傳導(dǎo)蛋白的特征結(jié)構(gòu)有一致性,因此認(rèn)為可能是一個感應(yīng)細(xì)胞外化學(xué)物質(zhì)濃度變化的傳導(dǎo)蛋白.使用熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)克隆了042BL-1及042BL-4中Tn5插入位點(diǎn)側(cè)翼序列.序列測定與BLAST比較結(jié)果表明,042BL-4中Tn5插入在共生大質(zhì)粒pSymA sma1789的基因中,命名為rstD基因,功能預(yù)

5、測rstD基因?yàn)榭赡艿南佘账岘h(huán)化酶.包括SAM(Sterile Alpha Motif)、腺苷酸環(huán)化酶催化結(jié)構(gòu)域和ATP酶結(jié)構(gòu)域,Tn5插入在其ATP酶結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū).042BL-1中Tn5插入在染色體上基因smc002407中,命名為rstE基因.PCR擴(kuò)增得到包含啟動子的rstD和rstE全長,將其克隆至穿梭載體pBBR1MCS-5上.經(jīng)三親本雜交將完整的rstD基因和rstE基因轉(zhuǎn)入突變株042BL-4和042BL-1中,使突變株

6、恢復(fù)耐鹽性,表明rstD和rstE基因都是與耐鹽有關(guān)的基因.PCR擴(kuò)增得到包含rstD基因中腺苷酸環(huán)化酶催化結(jié)構(gòu)域(CyaA)編碼區(qū)的DNA片段,將其克隆至自殺性質(zhì)粒pJQ2002SK上,然后將卡那盒插入CyaA編碼區(qū)中,構(gòu)建成CyaA編碼區(qū)插入突變的質(zhì)粒pJQ-cyaA4K.經(jīng)三親本雜交將其導(dǎo)入野生菌042B中,在5％的蔗糖選擇壓力下,得到CyaA編碼區(qū)的042B突變株.突變株的耐鹽性分析表明,與野生型042B相比突變型株的耐鹽性并無