2403.黏細(xì)菌、古菌漆酶序列篩選及其部分重組酶酶學(xué)性質(zhì)分析

1、Jiiiir[rrlllllllllll[rrlllllllllrll[rlllllllp10Y3215417，二：?！趈；髯‘～，’‘cj碩士學(xué)位論文密級保密期限黏細(xì)菌、古菌漆酶序列篩選及其部分重組酶酶學(xué)性質(zhì)分析Bioinformaticanalysisandenzymaticcharacterizationofmyxobactefiaandarchaealaccase—likenmlticopperoxidases學(xué)號姓名學(xué)位類別學(xué)

2、科專業(yè)(工程領(lǐng)域)指導(dǎo)教師完成時(shí)間答辯委員會主席簽名D14201037趙秀艷理學(xué)碩士生物化學(xué)與分子生物學(xué)肖亞中2017年2月燦》妒誓摘要漆酶是一種具有廣泛潛在應(yīng)用價(jià)值的多銅氧化酶。漆酶過去被認(rèn)為廣泛存在于植物、昆蟲和真菌中，而近年來，越來越多的細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了漆酶的存在。黏細(xì)菌是一類重要的資源菌，但與一般細(xì)菌相比，較難分離和純化，因此，黏細(xì)菌中關(guān)于漆酶的研究也較少。古菌常被發(fā)現(xiàn)生活在各種極端自然環(huán)境下，這些特殊的生活習(xí)性和與此相關(guān)的潛在生

3、物技術(shù)開發(fā)前景，一直吸引著人們的注意。在此，我們采用生物信息學(xué)的方法，綜合應(yīng)用BLAST和隱馬爾可夫模型方法對黏細(xì)菌蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并根據(jù)多銅氧化酶的保守銅離子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)一步篩選，獲得候選目的漆酶序列。我們通過構(gòu)建進(jìn)化樹的方法，對獲得的候選目的漆酶進(jìn)行分類，按照序列特征與類別從中挑選了9條目的漆酶序列進(jìn)行重組表達(dá)驗(yàn)證。以26甲氧基苯酚(DⅧ)和丁香醛連氮等底物檢測重組酶的催化活性，成功獲得7個(gè)黏細(xì)菌重組蛋白具有漆酶催化活性。針對

4、其中1個(gè)對DMP具有較高氧化活性的重組酶(來自纖維素堆囊菌，命名為rSC2)。通過Ni_NTA親和層析柱純化rSC2，測試其酶學(xué)性質(zhì)，最適反應(yīng)溫度為60。C，最適反應(yīng)pH范圍在中性到偏堿性范圍，在60℃孵育1h保留50％以上剩余酶活。這是首次對黏細(xì)菌漆酶序列進(jìn)行系統(tǒng)性的生物信息學(xué)分析，并實(shí)現(xiàn)纖維堆囊菌Sorangiumcellulosum序列來源的漆酶活性蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中的重組表達(dá)。同時(shí)，我們利用同樣的信息學(xué)方法對古菌進(jìn)行了全蛋白質(zhì)