17673.杜氏鹽藻s腺苷同型半胱氨酸水解酶相互作用蛋白的篩選與鑒定

1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterScreeningand‘dentificatiqofproteimthat：ScreenmgandidentiticationoforoteinsinteractwithSadenosylhomocystinehydrolasefromDunaliellasalinaByDandanChaiSupervisor：ProfL

2、exunXueCellBiologyDepartmentofBioengineering一一May2012摘要杜氏鹽藻S一腺苷同型半胱氨酸水解酶相互作用蛋白的篩選及鑒定摘要背景及目的S一腺苷同型半胱氨酸水解酶(Sadenosylhomocystinehydrolase，SAHH)是甲基化通路中一個(gè)關(guān)鍵的限速酶，可逆催化s腺苷同型半胱氨酸(Sadcnosylhomocystine，SAH)水解生成腺苷和同型半胱氨酸，SAH是所有依賴S腺苷

3、甲硫氨酸(Sadenosylmethionine，SAM)轉(zhuǎn)甲基酶的反應(yīng)產(chǎn)物，作為產(chǎn)物抑制劑SAH水平的增加可以抑制依賴SAM轉(zhuǎn)甲基酶作用，因此SAHH快速分解SAH成為甲基化進(jìn)行的先決條件。SAHH不但作為生物轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)的調(diào)節(jié)者，而且在作為抗寄生蟲藥物靶點(diǎn)以及治療腫瘤、艾滋病等重大疾病都有深入的研究。為了研究杜氏鹽藻SAHH的細(xì)胞內(nèi)在分子作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建S一腺苷同型半胱氨酸水解酶的酵母雙雜交誘餌表達(dá)載體pGBKT7SAHH，通過(guò)

4、酵母雙雜交技術(shù)篩選杜氏鹽藻細(xì)胞cDNA文庫(kù)與杜氏鹽藻SAHH相互作用的蛋白，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)FarWesternblotting、Hispulldown和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)免疫共沉淀來(lái)驗(yàn)證酵母雙雜交的陽(yáng)性結(jié)果。方法1SAHH相互作用蛋白的篩選用PCR方法擴(kuò)增杜氏鹽藻SAHH的開放閱讀框，酶切鑒定以及測(cè)序正確后，將其與酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7連接，構(gòu)建誘餌表達(dá)載體pGBKT7SAHH。用PEG／LiAc法將誘餌載體轉(zhuǎn)入AHl09和Y187酵母細(xì)