S-腺苷同型半胱氨酸水解酶在纖毛-鞭毛組裝及食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、食管鱗癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，尤其是華北地區(qū)。雖經(jīng)過多年的研究，但其發(fā)生發(fā)展的分子機制仍不十分清楚。纖毛/鞭毛是進化上非常保守的細胞器，鞭毛/纖毛不僅作為運動推動器，而且也可作為一個細胞“天線”，接收來自其他細胞和環(huán)境的物理、化學信號，向細胞核傳遞這些信號以引起細胞反應。纖毛結構或功能上的異常導致一系列人類疾病的發(fā)生，包括腫瘤。作為引發(fā)多條信號通路活化的重要細胞器，纖毛在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，而鞭毛組裝和腫瘤發(fā)生的分子機制目前

2、還不清楚。直接以人的纖毛為對象研究纖毛的組裝過程是困難的，大多數(shù)腫瘤細胞的纖毛都出現(xiàn)了缺失。因此我們以雙鞭毛無細胞壁的單細胞真核生物——杜氏鹽藻的鞭毛為模式細胞器來研究纖毛組裝機制在食管鱗癌發(fā)生中的作用。
　　纖毛/鞭毛是一個基于微管的細胞器，鞭毛內(nèi)運輸(IFT)是目前研究比較清楚的纖毛/鞭毛組裝機制，但是其調(diào)控機制尚不明確。IFT的調(diào)控機制是一個精密且復雜的過程，肯定有多種調(diào)控途徑存在，而蛋白的翻譯后修飾是一種比較常見的調(diào)控手段

3、。蛋白翻譯后修飾包括磷酸化、乙?；?、多糖化、氨基乙?；?、谷氨酰基化、甲基化。研究人員推測IFT馬達蛋白、IFT復合物及相關蛋白可能通過一種或多種翻譯后修飾來調(diào)節(jié)馬達蛋白自身的相對活性及其與IFT復合物蛋白、貨物(cargo)的相互作用。實際上，研究人員已發(fā)現(xiàn)蛋白磷酸化和去乙酰化在衣藻鞭毛和組織細胞初級纖毛的解聚中發(fā)揮著重要作用，且微管蛋白tubulin的乙?；?、去酪氨酸化(detyrosination)、谷氨?；?glutamylati

4、on)、甘氨酰化（glycylation）在軸絲微管的組裝和維持中發(fā)揮重要作用。但是，關于纖毛/鞭毛蛋白甲基化方面的報導還比較少，Schneider等人在2008年在衣藻鞭毛重吸收過程中檢測到四個軸絲蛋白不對稱的雙甲基化，而Sloboda等人在完整的鞭毛中發(fā)現(xiàn)了三個高度甲基化蛋白，但這些蛋白的功能研究還未見報道。前期的研究表明，一些小的鳥苷三磷酸酶(GTPase)和蛋白磷酸酶2A的催化亞基在細胞的信號傳導中被甲基化。甲基化修飾可能會影響

5、蛋白-蛋白的相互作用或者酶的活性，從而對信號傳導和蛋白靶向的調(diào)節(jié)起關鍵作用。
　　保守的S-腺苷同型半胱胺酸水解酶(SAHH)是甲基化途徑中降解S-腺苷同型半胱胺酸(SAH)的唯一水解酶，SAH對甲基化通路具有反饋抑制作用，對SAHH的抑制會導致細胞內(nèi)SAH的增多，從而導致對甲基化途徑的抑制。最近，SAHH抑制劑在抗病毒抗寄生蟲方面得到廣泛的關注，同時，研究發(fā)現(xiàn)一些人類疾病的發(fā)生與細胞內(nèi)SAHH水平的變化密切相關。例如，細胞內(nèi)SA

6、HH水平的異常會導致人類心血管疾病的發(fā)生，從2004年在南斯拉夫已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7起致死事件是由于SAHH的異常造成的，2008年Leal等人通過全基因組功能缺失篩選出五個新的推測抑癌基因，SAHH就是其中之一，研究人員發(fā)現(xiàn)在包括直腸癌和肺癌在內(nèi)的腫瘤中SAHH表達下調(diào)。SAHH作為一個新的抑癌基因，它的抑癌作用是否與纖毛調(diào)控有直接或間接的關系呢？
　　Pazour等人通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)萊因衣藻的SAHH的肽段存在于其鞭毛的組分中，為了研究

7、纖毛在食管鱗癌發(fā)生中的作用，本研究以鞭毛再生過程中篩選出的差異表達基因SAHH為目的基因，從兩個方面對SAHH在胞內(nèi)可能發(fā)揮的功能進行了研究:1、檢測SAHH在杜氏鹽藻鞭毛再生過程中的作用。2、觀察食管鱗癌組織和細胞株EC9706和Eca109中SAHH表達情況，構建eGFP-N1-SAHH真核過表達，并觀察SAHH的過表達對食管鱗癌細胞株EC9706和Eca109的增殖、凋亡、侵襲、細胞周期及細胞形態(tài)的的影響。
　　第一部分:S

8、AHH在纖毛/鞭毛組裝中的作用
　　目的:
　　以杜氏鹽藻鞭毛為模式細胞器研究纖毛組裝在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，構建鞭毛再生模型，篩選鞭毛再生過程中差異表達基因，并研究其在鞭毛再生過程中的作用，為研究纖毛組裝在食管鱗癌中的作用奠定基礎。
　　方法:
　　第一章杜氏鹽藻鞭毛組裝模型的構建及差異基因的篩選
　　1、運用pH休克的方法構建杜氏鹽藻鞭毛再生過程;
　　2、提取野生型和pH休克后再生1h的杜氏鹽

9、藻細胞總RNA的通過Illumina高通量測序平臺對轉(zhuǎn)錄組進行測序、組裝、注釋、功能分類，并篩選出差異表達基因。
　　第二章dsSAHH在杜氏鹽藻鞭毛組裝中的作用結果:
　　1、通過RACE巢式PCR擴增篩選出來的dsSAHH全長序列;
　　2、構建pET28a(+)-dsSAHH原核表達載體，誘導dsSAHH蛋白的表達并制備其抗體;
　　3、通過Westernblotting和實時熒光定量PCR(real-ti

10、mePCR)檢測dsSAHH檢測在鞭毛再生過程中蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平上的變化;
　　4、間接免疫熒光法檢測dsSAHH在杜氏鹽藻細胞中的定位。
　　5、構建p7NBT-dsSAHH真核表達載體，觀察dsSAHH在杜氏鹽藻細胞中的過表達對鞭毛再生的影響;
　　6、通過掃描電鏡觀察SAHH抑制劑DZA對杜氏鹽藻鞭毛再生的影響;
　　7、酵母雙雜技術篩選dsSAHH互作蛋白，并由體內(nèi)外實驗驗證其相互作用。
　　結果

11、：
　　第一章杜氏鹽藻鞭毛組裝模型的構建及差異基因的篩選
　　1、運用pH休克的方法構建杜氏鹽藻鞭毛再生過程;
　　2、提取野生型和pH休克后再生1h的杜氏鹽藻細胞總RNA的通過Illumina高通量測序平臺對轉(zhuǎn)錄組進行測序、組裝、注釋、功能分類，并篩選出差異表達基因。
　　第二章dsSAHH在杜氏鹽藻鞭毛組裝中的作用
　　1、經(jīng)3'和5'RACE擴增后，得到一個全長為1，926bp的cDNA片段，其中包括

12、1，458bp的ORF，編碼458個氨基酸，預測的分子量為52.8kD，等電點(pI)為5.70;
　　2、16℃過夜培養(yǎng)，1mMIPTG成功誘導可溶性dsSAHH蛋白的表達，并制備其抗體，用于后續(xù)實驗;
　　3、Real-timePCR和westernblotting結果顯示:杜氏鹽藻dsSAHH基因在鞭毛再生過程中在蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平都表達上調(diào);
　　4、間接免疫熒光結果顯示:dsSAHH不僅存在于細胞核和細胞質(zhì)內(nèi)

13、，在鞭毛內(nèi)也有定位;
　　5、在dsSAHH過表達的杜氏鹽藻細胞株中，pH休克后其鞭毛再生時間縮短，表明dsSAHH能促進杜氏鹽藻鞭毛的再生;
　　6、經(jīng)SAHH抑制劑DZA(25μM)處理后，杜氏鹽藻鞭毛不能再生，表明SAHH抑制劑DZA處理能抑制鞭毛再生。
　　7、酵母雙雜實驗篩選出與dsSAHH相互作用的蛋白dsRACK1，并通過pulldown和免疫共沉淀等實驗驗證了它們相互作用。
　　小論:
　　

14、通過pH休克的方法我們成功構建了杜氏鹽藻鞭毛再生模型，RNA-seq測序篩選出鞭毛再生過程中的差異unigene25，373個，有注釋的7，476個。差異基因dsSAHH在杜氏鹽藻鞭毛再生過程中表達量上調(diào)，它在杜氏鹽藻細胞中的過表達能促進鞭毛的再生，而其抑制劑DZA能抑制鞭毛再生。
　　第二部分SAHH在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用
　　目的:
　　研究SAHH作為新預測的抑癌基因在是食管鱗癌組織和細胞中的表達情況，鑒于前

15、面的實驗結果觀察人源S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(hSAHH)的過表達對食管鱗癌細胞凋亡、增殖、粘附、遷移能力及細胞周期、細胞形態(tài)的影響，初步鑒定SAHH對食管鱗癌的作用是否與纖毛相關。
　　方法:
　　第一章SAHH在正常食管上皮細胞和食管鱗癌細胞中的表達差異
　　1、分別提取正常食管上皮細胞Het-1A和食管鱗癌細胞EC9706和Eca109的總蛋白和mRNA，Westernblotting和real-timePCR

16、檢測hSAHH在各中的表達。
　　2、免疫組化檢測hSAHH食管鱗癌組織和癌旁正常組織中的表達。
　　第二章SAHH過表達對食管鱗癌細胞的影響
　　1、構建pEGFP-N1-SAHH真核表達載體，轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞株和正常食管上皮細胞;
　　2、分別用Westernblotting、細胞S腺苷同型半胱氨酸(SAH或AdoHcy)酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測試劑盒和同型半胱氨酸(Hcy)檢測試劑盒檢測SAHH過表達后細胞

17、內(nèi)SAHH、SAH和Hcy水平;
　　3、使用EdU細胞增殖試劑盒，經(jīng)Apollo(@)和Hoechst33342染色，利用熒光顯微鏡觀察SAHH過表達細胞的增殖;
　　4、以TUNEL法和Westernblotting檢測SAHH過表達的食管鱗癌細胞株和正常食管上皮細胞的凋亡情況;
　　5、細胞經(jīng)PI染色，用FCM法測定SAHH過表達前后細胞周期分布;
　　6、利用Transwell細胞侵襲實驗檢測SAHH過表

18、達細胞的遷移能力;
　　7、掃描電鏡觀察SAHH的過表達對食管鱗癌細胞纖毛的影響。
　　8、Co-IP驗證人源SAHH和RACK1的相互作用，Westernblotting檢測SAHH過表達后RACK1的變化情況。
　　結果:
　　第一章SAHH在正常食管上皮細胞和食管鱗癌細胞中的表達差異
　　1、免疫組化和real-timePCR檢測結果發(fā)現(xiàn)，hSAHH在食管鱗癌組織與癌旁正常組織中都有表達，但是在食管鱗

19、癌組織中表達下調(diào);
　　2、與正常食管上皮細胞Het-1A相比，Eca109和EC9706細胞中SAHH在mRNA水平上分別上升28.8％和42.2％(P＜0.05)，而蛋白水平則分別降低13.5％(P＜0.05)和53.6％(P＜0.001);
　　第二章hSAHH過表達對食管鱗癌細胞的影響
　　1、成功構建EGFP-N1-SAHH真核表達載體，在食管鱗癌細胞株和正常食管上皮Het-1A中的轉(zhuǎn)染率達90％以上;

20、>　　2、與轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的細胞相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-SAHH的Eca109、EC9706和Het-1A細胞內(nèi)SAHH蛋白表達顯著升高(P＜0.05)。與此同時，Eca109、EC9706細胞內(nèi)SAH濃度顯著降低而Hcy濃度顯著增加(P＜0.05）;而轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-SAHH的Het-1A細胞相對轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的細胞SAH和Hcy濃度變化不明顯（P＞0.05）;
　　3、Westernblotting結果顯

21、示，與轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的細胞相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-SAHH的Eca109和EC9706內(nèi)凋亡因子caspase-3分別增加～1.6倍和～3.15倍(P＜0.05);TUNEL試驗結果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-SAHH的Eca109和EC9706的細胞凋亡率分別為6.749±0.045％和9.869±0.078％(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的Eca109和EC9706的細胞凋亡率分別為1.777±0.011％和2.9

22、67±0.053％;
　　4、EdU實驗和流式細胞儀檢測結果發(fā)現(xiàn)，SAHH的過表達對Eca109和EC9706細胞的增殖及細胞在G0/G1、S和G2/M期的分布的影響不顯著(P＞0.05);
　　5、Westernblotting檢測發(fā)現(xiàn)粘附因子E-cadherin在轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-SAHH的Eca109和EC9706的細胞中表達量增加而ICAM-1則隨著SAHH表達量增加而減少;在Transwell小室實驗中轉(zhuǎn)染pE

23、GFP-N1-SAHH的Eca109和EC9706細胞遷移數(shù)為124.17±41.32和73.25±13.38而轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的Eca109和EC9706的遷移細胞數(shù)為205.25±28.19和173.33±38.28(P＜0.05)，表明SAHH的過表達能抑制食管鱗癌細胞的遷移;
　　6、掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)SAHH過表達對食管鱗癌細胞纖毛的影響不明顯;
　　7、Co-IP證實人源SAHH與RACK1在體內(nèi)也是相互作用的

24、，并且RACK1在ESCC細胞株中表達量隨著SAHH表達量增多而增多（P＜0.05）。
　　小論:
　　高度保守的hSAHH基因在食管鱗癌組織和細胞中都呈現(xiàn)出表達量下降，本研究中對其在食管鱗癌細胞株Eca109和EC9706中的過表達導致了細胞內(nèi)SAH濃度下降而Hcy濃度增加，促進了食管鱗癌細胞的凋亡，抑制了其遷移和粘附，但是對其增殖和細胞周期分別沒有顯著影響。此外，hSAHH蛋白與骨架蛋白hRACK1無論在杜氏鹽藻細胞中還