As-shGRP78增強(qiáng)腺苷與同型半胱氨酸抗肝癌HepG2細(xì)胞作用的研究.pdf

1、目的：
　　1.使用RNAi技術(shù)下調(diào)GRP78表達(dá)，聯(lián)合使用腺苷（Ado）與同型半胱氨酸（Hcy），檢測(cè)對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用、凋亡相關(guān)機(jī)制及表觀遺傳學(xué)改變。
　　2.采用GatewayTM克隆技術(shù)構(gòu)建人長(zhǎng)鏈非編碼RNA MEG3過(guò)表達(dá)的重組慢病毒載體。
　　方法：
　　1.通過(guò)前期構(gòu)建的Ad-shGRP78轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞下調(diào)GRP78的表達(dá)，聯(lián)合使用Ado與Hcy，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖；DAPI核染檢測(cè)凋

2、亡；FCM/PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期；Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。
　　2. RT-PCR檢測(cè)MEG3表達(dá)、MSP檢測(cè)MEG3啟動(dòng)子甲基化；
　　3.構(gòu)建MEG3基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-MEG3；
　　4.采用GatewayTM克隆技術(shù)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入293FT細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝并完成滴度測(cè)定。
　　5.重組慢病毒MEG3轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，RT-PCR評(píng)價(jià)過(guò)表達(dá)效果。
　　結(jié)果：

3、　　1、MTT結(jié)果表明:下調(diào)GRP78可增強(qiáng)Ado與Hcy誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的增殖抑制。
　　2、DAPI結(jié)果表明：下調(diào)GRP78可增強(qiáng)Ado與Hcy誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡。
　　3、FCM/PI結(jié)果表明：下調(diào)GRP78可增強(qiáng)Ado與Hcy誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞周期阻滯。
　　4、Western blot結(jié)果表明：Ado與Hcy可以通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，下調(diào)GRP78可以增強(qiáng)凋亡作用。Ado與Hcy可通

4、過(guò)p53來(lái)阻滯細(xì)胞周期。
　　5、Ado與Hcy聯(lián)合作用可改變MEG3啟動(dòng)子甲基化水平，活化MEG3基因。
　　6、成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-MEG3，在293FT細(xì)胞中包裝重組慢病毒Lv-MEG3；成功在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MEG3。
　　結(jié)論：
　　1.分子伴侶GRP78在應(yīng)激狀態(tài)下具有保護(hù)細(xì)胞生存的作用。下調(diào) GRP78可明顯增強(qiáng) Ado與Hcy對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性效應(yīng)，包括誘導(dǎo)細(xì)胞增殖抑制

5、、通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑與線粒體途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。下調(diào)GRP78可以增強(qiáng)Ado與Hcy誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，涉及活化caspase-4、CHOP等ERS相關(guān)通路因子及細(xì)胞色素C，caspase-9、caspase-3等線粒體途徑相關(guān)蛋白。Ado與Hcy聯(lián)合作用可阻滯細(xì)胞于G0/G1期，涉及P53、MDM-2、CyclinD1等細(xì)胞周期相關(guān)因子。同時(shí)下調(diào)GRP78可以增強(qiáng)細(xì)胞周期阻滯的作用。
　　2. Ado與Hcy聯(lián)合用藥可降