水稻抽穗期基因的鑒定及與HAF1互作基因的功能研究.pdf

1、水稻（Oryza sativa）作為一種重要的糧食作物，養(yǎng)育著全球近1/2的人口。抽穗期作為影響水稻產(chǎn)量的一個重要性狀，關(guān)系到水稻種植的季節(jié)性和地域性。本課題組通過T-DNA標(biāo)簽插入方法創(chuàng)建了一批水稻突變體材料，并克隆了Heading date Associated Factor1（HAF1）等水稻抽穗期基因(Yang et al.，2015)。本研究利用MutMap方法定位水稻抽穗期基因，并用遺傳雜交和分子檢測等手段對HAF1互作基因

2、展開研究，取得結(jié)果如下:
　　1.本實(shí)驗(yàn)室前期通過篩選水稻插入突變體庫鑒定到兩份晚抽穗材料N116、KO和兩份不抽穗材料N108、MT。本研究通過將這四個突變體（或鑒定的雜合基因型）分別與RID1雜合株雜交，根據(jù)F1后代表型，確定這四個突變體都不是不抽穗基因rid1的等位突變體(Wu et al.，2008)。參考改良的MutMap方法，將N116、KO、N108和MT突變體（或鑒定的雜合基因型）分別與經(jīng)甲磺酸乙酯處理后表型正常的

3、ZH11(EMSZH11)或日本晴雜交獲得四個F2家系，所有F2家系抽穗期出現(xiàn)分離，且分離比符合3∶1，說明這些突變表型各是由單個隱性基因控制的。從每個分離家系中各取30株突變型和30株野生型植株分別構(gòu)建DNA池，對其進(jìn)行全基因組重測序，采用MutMap方法分析數(shù)據(jù)，并對其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明:N116是Ehd3的等位基因，該基因的第848位堿基發(fā)生G到T的替換，導(dǎo)致其編碼的甘氨酸突變?yōu)榻K止密碼子從而使蛋白翻譯提前終止;KO編碼一個MYB

4、轉(zhuǎn)錄因子，是擬南芥AtL UX的同源基因，該基因第712位堿基發(fā)生C到A的替換，導(dǎo)致MYB結(jié)構(gòu)域的組氨酸突變?yōu)楣弱０匪?N108、MT的突變基因分別定位在水稻第9號染色體末端和第6號染色體。
　　2.HAF1編碼一個含有C3HC4 RING Finger結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶(Yang et al.，2015)。通過酵母雙雜交、BiFC、體外pull-down實(shí)驗(yàn)，證明HAF1能在體外和體內(nèi)與HAF1 INTERACTING FA

5、CTOR1(HIF1)互作。借助體外泛素化和體外降解實(shí)驗(yàn)，證明HAF1能在體外泛素化并介導(dǎo)HIF1的降解。進(jìn)一步的煙草體內(nèi)降解實(shí)驗(yàn)，證明HAF1能在體內(nèi)以依賴于26S蛋白酶復(fù)合體的方式降解HIF1。另外，利用分子和遺傳手段鑒定HIF1抑制材料(HIF1-crispr、HIF1-AMI)和HIF1超表達(dá)材料(HIF1-OX、HIF1-OX-GFP植株表型)，確定HIF1抑制材料在長日照條件下均表現(xiàn)為早花，而HIF1超表達(dá)材料在長日照條件下