水稻中調(diào)控抽穗期的關(guān)鍵基因OsCOL13的克隆與生化分析.pdf

1、水稻（Oryza sativa）作為重要的糧食作物之一，為全世界數(shù)十億的人提供能量。水稻是一個短日照植物，在開花方面表現(xiàn)出強烈的光周期敏感性。開花在植物整個生命周期中起著重要的作用，它決定了植物對不同外部環(huán)境的適應性，同時也受到內(nèi)部信號和外界環(huán)境刺激的影響。在所有的開花調(diào)控因子中，光周期是最重要且被廣泛研究的影響因素。目前許多參與到光周期途徑的基因已經(jīng)在長日照植物擬南芥以及短日照植物水稻中被鑒定出來，同時建立起了OsGI/GI-Hd1/

2、CO-Hd3a/FT信號調(diào)控網(wǎng)絡。其中CONSTANS(CO)作為擬南芥的開花整合子在長短日照條件下都促進開花。但水稻中CO的同源基因Heading date1（Hd1）卻起到雙重相反的功能，它在長日照條件下抑制開花，在短日照條件下誘導開花。
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一個水稻CONSTANS-like（COL）基因OsCOL13，它參與到水稻光周期開花調(diào)控過程中。為了研究OsCOL13在開花調(diào)控中所起的作用，我們通過遺傳學、分子

3、生物學、生物化學和細胞學等技術(shù)手段對OsCOL13的功能進行了深入解析。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)OsCOL13抑制水稻開花。無論在短日照條件(14h黑暗/10h光照)還是在長日照條件（10h黑暗/14 h光照）下，OsCOL13過表達植株都比野生型Kitaake延遲開花3周左右。同時，將OsCOL13基因過表達到另外兩種光周期敏感的粳稻品種中花11和W030中，轉(zhuǎn)基因植株開花時間也顯著延遲。利用CRISPR-Cas9技術(shù)我們

4、獲得了三個獨立的OsCOL13突變體，但突變體與野生型相比開花時間沒有明顯變化，暗示OsCOL13可能與其它的OsCOL基因存在功能冗余。
　　(2)OsCOL13主要在葉片、葉鞘、莖桿以及穗子中表達，在根中相對比較低，同時在不同發(fā)育階段葉片中的表達維持穩(wěn)定。此外，GUS組織化學染色實驗發(fā)現(xiàn)，在所有組織中都能檢測到GUS活性，暗示OsCOL13組成型表達。原位雜交顯示OsCOL13在葉片的葉肉細胞中大量表達。
　　(3)Os

5、COL13是一個節(jié)律表達的基因，其表達受到光照和節(jié)律鐘的調(diào)控。OsCOL13的轉(zhuǎn)錄水平在長短日照下都是從傍晚開始積累，在黎明時達到最大，之后迅速降低直至傍晚。OsCOL13的表達在整個營養(yǎng)生長階段沒有太大的變化，并且長日照下的表達量要高于短日照條件下的表達量，同時在全光照條件下OsCOL13能維持節(jié)律性振幅也沒有改變，而在全黑暗條件下雖然還能維持節(jié)律表達，但其振幅急劇減少。
　　(4)通過在水稻原生質(zhì)體中觀察OsCOL13-GFP

6、融合蛋白的熒光信號，發(fā)現(xiàn)OsCOL13嚴格的定位于細胞核中，與核參照蛋白D53-mCherry完全重疊。OsCOL13-BD融合蛋白與BD對照相比在酵母菌株AH109中展現(xiàn)出更強的轉(zhuǎn)錄激活活性，并且激活域位于B-box和CCT兩個保守的結(jié)構(gòu)域之間，與已報道的CO和DTH2相類似。這些結(jié)果表明，OsCOL13可能作為一個轉(zhuǎn)錄激活子調(diào)節(jié)下游基因的表達。
　　(5)OsCOL13與自身互作，以同源二聚體的形式行使功能。當用Flag標簽抗

7、體檢測過表達植株中OsCOL13-Flag融合蛋白時，我們發(fā)現(xiàn)一條約為70 kDa的條帶，它是OsCOL13-Flag單體蛋白的兩倍。隨著提取緩沖液中DTT濃度的增加，70 kDa條帶逐漸減弱，而一條35 kDa的條帶逐漸增強。暗示OsCOL13可能以二聚體的形式存在。此外，體外pull-down和BiFC實驗進一步證實OsCOL13可以形成二聚體。
　　(6)OsCOL13在水稻開花調(diào)控網(wǎng)絡中位于OsphyB的下游Ehd1的上游

8、。OsCOL13作為一個組成型的負調(diào)節(jié)子，通過下調(diào)Ehd1的表達進而抑制Hd3a和RFT1的表達，從而延遲開花，并且獨立于其它的Ehd1調(diào)節(jié)子。通過在水稻開花相關(guān)的近等基因系以及突變體中檢測OsCOL13的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)OsCOL13的表達量在osphyb突變體中顯著降低，暗示OsphyB可能促進OsCOL13的表達。
　　(7)OsCOL13直接調(diào)控OsLBD38的表達。轉(zhuǎn)錄譜分析發(fā)現(xiàn)OsLBD38基因可能直接受OsCOL13的