15862.擬南芥一個假定的高親和性ni2co2轉運蛋白(athan)的功能解析

1、學位論文學校代碼：10225學號：S13083擬南芥一個假定的高親和性Ni2／C02轉運蛋白(AtHAN)的功能解析指導教師姓名：申請學位級別：論文提交日期：授予學位單位：任翔宇張欣欣教授東北林業(yè)大學碩士學科專業(yè)：生物化學與分子生物學2013年4月論文答辯日期：2013年6月13日東北林業(yè)大學授予學位日期：2013年6月答辯委員會主席：論文評閱人：聾歲厶彤素大學摘要摘要鎳是植物體內一種必需的微量營養(yǎng)元素。它是脲酶的金屬輔基，脲酶的作用是

2、催化尿素水解，廣泛分布于細菌、真菌、藻類及高等植物中。此外在某些微生物中，鎳還是鎳鐵氫化酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰輔酶A脫羧酶／合成酶、超氧化物岐化酶SodN和甲基輔酶M還原酶的必須組分。鈷沒有被定義為必需的營養(yǎng)元素，但在許多種植物中均發(fā)現(xiàn)了這種元素。大量研究都表明加少量鈷對作物產(chǎn)量有積極作用，因此將其定義為有益元素。金屬離子轉運蛋白在細胞、組織和器官水平上擔負著吸收及運送金屬離子功能。目前從擬南芥中克隆到的金屬離子轉運蛋白家族主要有ZI

3、P家族、YSL家族和NRAMP家族。對微生物的研究中，發(fā)現(xiàn)了高親和性的鎳鈷離子轉運蛋白。這種高親和性鎳和鈷的吸收過程主要依賴于ABC轉運系統(tǒng)和其他一些次級轉運蛋白。目前在植物體內鎳鈷離子的吸收轉運過程尚不清楚，幾乎沒有有關鎳鈷轉運蛋白的研究報道。本研究從模式植物擬南芥中，克隆得到一個基因(At4935080)，該基因編碼一個假定的高親和性Ni2／C02的轉運體(aputativehighaffinitynickel／cobalttran

4、sporter)(簡稱AtHAN)。經(jīng)測序AtHAN基因開放閱讀框(ORF)長為1098bp，編碼365個氨基酸，對其氨基酸序列進行了功能域分析，預測AtHAN的140364個氨基酸具有高親和地轉運鎳鈷離子的功能，是有5個跨膜區(qū)的跨膜蛋白。將pREP3AtHAN重組質粒和pREP3空載體轉化到酵母鎳離子吸收缺陷型菌株Aniclp中，使用原子吸收光譜法測定了轉基因酵母中鎳鉆離子的含量。結果表明AtHAN參與了酵母細胞對于鎳離子和鉆離子的吸

5、收過程。但是在添加不同濃度鎳離子的培養(yǎng)基上，轉基因酵母的生長相對于對照沒有明顯差別；添加06mM鈷時轉基因酵母的生長差于對照。我們推測酵母細胞對于鎳離子的需要量很低(nM級別)，培養(yǎng)環(huán)境中充足的鎳源足以保證酵母細胞的正常生長。過量的添加鎳離子對轉基因酵母和對照均具有脅迫作用，故生長沒有明顯的差別。酵母中的亞細胞定位研究表明，AtHAN蛋白定位于酵母細胞內質網(wǎng)上。對AtHAN基因的表達特性的研究表明AtHAN基因在花和根中的表達量較高，基

6、因的表達受環(huán)境中鎳離子和鈷離子含量的影響。將AtHAN基因構建到植物表達載體pBll21，并轉化到擬南芥中鑒定得到AtHAN過表達植株。相對于野生型植株過表達擬南芥對較高濃度的鈷表現(xiàn)出敏感性，而鎳處理下沒有表現(xiàn)出明顯的表型特征。40ItM、l50ItMCoCl2的處理條件下，過表達擬南芥植株葉中C02的積累量大于野生型，根中積累量基本相同。而NiS04處理條件下根和葉中的Ni2的積累量基本相同。推測AtHAN可能參與了鈷離子的運輸，使過