油菜高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BnPht1;4的功能研究.pdf

1、磷是植物生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素之一，它既是植物體內(nèi)許多重要有機(jī)化合物的組分，同時(shí)又參與植物體內(nèi)多種代謝過程，如碳水化合物代謝、氮素代謝、脂肪代謝等。植物對土壤中磷素的吸收主要以無機(jī)磷(Pi)的形式。土壤對磷的強(qiáng)烈吸附使土壤溶液中植物可吸收的可溶性無機(jī)磷的含量非常低。研究高效吸收和利用土壤磷素營養(yǎng)能力的分子機(jī)制，可能為了解高等植物復(fù)雜的磷素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)提供了有價(jià)值的科學(xué)資料。而且，克隆鑒定高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，并研究揭示其功能，具有重

2、要的生物學(xué)理論意義和潛在的農(nóng)業(yè)利用價(jià)值。本研究從油菜中克隆了一個(gè)高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，命名為BnPht1;4，對該基因在植物低磷應(yīng)答中的功能進(jìn)行了分析，主要研究結(jié)果如下:
　　1.BnPht1;4基因的分離鑒定和特征分析
　　從油菜cDNA文庫中克隆了一個(gè)cDNA序列，其開放閱讀框(openreadingframe，ORF)為1605bp，編碼532個(gè)氨基酸。序列分析預(yù)測該基因編碼的蛋白與擬南芥中的高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtPht

3、1;4具有95％的相似性，因此將該基因命名為BnPht1;4。
　　2.BnPht1;4蛋白的亞細(xì)胞定位分析
　　為了確定BnPht1;4蛋白的亞細(xì)胞定位，我們構(gòu)建了融合表達(dá)載體BnPht1;4-GFP，利用基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，在共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)該蛋白定位在質(zhì)膜上。拓?fù)鋵W(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有12個(gè)跨膜區(qū)域，在第6和第7個(gè)跨膜區(qū)域間被分成兩組。
　　3.BnPht1;4的組織表達(dá)分析
　　為了研究BnPh

4、t1;4在正常條件和低磷條件下在油菜中的表達(dá)模式，我們提取了油菜根、下胚軸、子葉、莖、葉和花等不同組織的總RNA，進(jìn)行RT-PCR分析。正常磷處理時(shí)，該基因在莖和花中的表達(dá)量較高;用低磷處理時(shí)，在根中的表達(dá)量顯著上調(diào)，并且在處理12h后，其表達(dá)量急劇增加。
　　4.BnPht1;4啟動(dòng)子分離及活性分析
　　從油菜基因組DNA中分離了BnPht1;4啟動(dòng)子，大小為1276bp。利用PlantCARE程序?qū)υ撔蛄蟹治霭l(fā)現(xiàn)，它含有

5、2個(gè)P1BS和2個(gè)W-box結(jié)合基序，GARE、TGA、TCA和ABRE等激素應(yīng)答元件，及MBS和LTR非生物脅迫應(yīng)答元件。
　　將BnPht1;4啟動(dòng)子構(gòu)建到GUS融合表達(dá)載體中進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化，對篩選出的陽性苗進(jìn)行GUS活性分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蔗糖達(dá)到一定濃度時(shí)，用低磷處理后，在根部發(fā)現(xiàn)較強(qiáng)的GUS信號，說明該基因受低磷誘導(dǎo)，并且依賴于蔗糖的存在。
　　5.過量表達(dá)BnPht1;4影響擬南芥根發(fā)育
　　將BnPht1;

6、4構(gòu)建到過量表達(dá)載體上，導(dǎo)入擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行表型分析。在正常磷處理下，過量表達(dá)BnPht1;4轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型相比，根和地上部分都沒有明顯差異;經(jīng)低磷(50μMPi)處理后，轉(zhuǎn)基因植株的鮮重高于野生型，主根的伸長顯著長于野生型;盡管轉(zhuǎn)基因植株的側(cè)根的密度少于野生型，但是側(cè)根數(shù)目多于野生型;無機(jī)磷含量的測定也得出過量表達(dá)在地上部分和根中都高于野生型。
　　6.低磷應(yīng)答下BnPht1;4受PHR1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控
　

7、　分析發(fā)現(xiàn)BnPht1;4啟動(dòng)子含有兩個(gè)PHR1結(jié)合元件P1BS，前期研究表明PHR1能與BnPht1;4啟動(dòng)子相互作用，調(diào)控BnPht1;4表達(dá)。為進(jìn)一步分析這兩個(gè)P1BS結(jié)合元件在BnPht1;4低磷誘導(dǎo)中的重要性，分別對這兩個(gè)元件進(jìn)行缺失突變，構(gòu)建了單P1BS和雙P1BS突變的重組載體BnPht1;4PM1∶GUS,BnPht1;4PM2∶GUS和BnPht1;4PMM∶GUS，轉(zhuǎn)化擬南芥。對篩選出的轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行低磷處理，觀察

8、GUS活性。組織化學(xué)染色分析發(fā)現(xiàn)，低磷處理后，單P1BS突變(BnPht1;4PM1和BnPht1;4PM2)后BnPht1;4啟動(dòng)子低磷誘導(dǎo)活性下降。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中雙P1BS突變(BnPht1;4PMM)后BnPht1;4啟動(dòng)子低磷誘導(dǎo)活性并沒有完全消失，這暗示在低磷應(yīng)答時(shí)，除了PHR1，可能還存在其它轉(zhuǎn)錄因子對BnPht1;4進(jìn)行調(diào)控。
　　7.BnPht1;4可能受WRKY75轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控
　　擬南芥中WRKY家族的