Endostatin、VCAM-1在BMT小鼠骨髓造血重建中的作用及川芎嗪對其表達(dá)水平的影響.pdf

1、第一部分川芎嗪對BMT小鼠骨髓組織中Endostatin、VCAM-1表達(dá)的影響及意義 目的：探討川芎嗪對骨髓移植(BMT)小鼠骨髓中Endostatin、VCAM-1表達(dá)水平的影響及其促進(jìn)骨髓造血重建的機(jī)制。 方法：72只清潔級近交系BALB/c小鼠(H-2d，MLSb)隨機(jī)分為正常組、生理鹽水組和川芎嗪組。正常組未作任何處理，生理鹽水組和川芎嗪組在BMT后分別喂飼相同劑量的生理鹽水(0.2ml/只，每天2次)和川芎嗪

2、(2mg/只，每天2次)，直至處死為止。BMT后第7、14、21、28天取眼眶血計數(shù)外周血細(xì)胞，取股骨計數(shù)骨髓單個核細(xì)胞(BMMNC)，HE染色分析骨髓造血組織容量、脂肪組織容量和成熟紅細(xì)胞容量變化，用流式細(xì)胞儀檢測骨髓BMMNCs的VLA-4表達(dá)水平，以免疫組織化學(xué)法檢測骨髓組織中Endostatin、VCAM-1的表達(dá)水平。 結(jié)果：川芎嗪組小鼠在BMT后第7、14、21天外周血紅細(xì)胞以及BMT后第7、14、21、28天外周血

3、白細(xì)胞、血小板、BMMNC計數(shù)、骨髓造血組織容量以及VCAM-1表達(dá)水平均顯著高于生理鹽水組(P＜0.01或P＜0.05)，成熟紅細(xì)胞容量和Endostatin表達(dá)水平均明顯低于生理鹽水組(P＜0.01或P＜0.05)。川芎嗪組小鼠脂肪組織容量在BMT后第7、14天明顯高于生理鹽水組(P＜0.01)，在第21、28天明顯低于生理鹽水組(P＜0.01)。流式細(xì)胞儀檢測到正常組VLA-4有表達(dá)，BMT后第7、14d川芎嗪組和生理鹽水組VLA

4、-4的熒光強(qiáng)度顯著低于正常組(P＜0.01或P＜0.05)，且川芎嗪組VLA-4在BMT后第14、21、28d均顯著高于生理鹽水組(P＜0.01)。免疫組織化學(xué)法檢測BMT后第7、14、21、28天川芎嗪組和生理鹽水組Endostatin表達(dá)水平顯著低于正常組(P＜0.01或P＜0.05)，且川芎嗪組低于生理鹽水組(P＜0.01或P＜0.05)；到第28天生理鹽水組已基本恢復(fù)正常，而川芎嗪組仍未恢復(fù)正常水平。BMT后第7、14、21天川

5、芎嗪組和生理鹽水組VCAM-1的表達(dá)均明顯低于正常組(P＜0.01或P＜0.05)，且川芎嗪組明顯高于生理鹽水組(P＜0.01或P＜0.05)，到第28天，川芎嗪組VCAM-1的表達(dá)已恢復(fù)正常，而生理鹽水組仍未恢復(fù)正常，兩組之間有顯著性差異(P＜0.01)。 結(jié)論：川芎嗪可能通過下調(diào)血管新生抑制因子Endostatin的表達(dá)而促進(jìn)造血微環(huán)境中微血管和靜脈竇的修復(fù)和血供的重建，川芎嗪還可以增強(qiáng)黏附分子VCAM-1、VLA-4的表達(dá)

6、，促進(jìn)歸巢的干/祖細(xì)胞與血管內(nèi)皮間的黏附作用，加強(qiáng)造血細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞的恢復(fù)，促進(jìn)骨髓移植后早期造血重建。 第二部分川芎嗪對BMT小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Endostatin、VCAM-1的影響 目的：探討同基因骨髓移植(BMT)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞Endostatin及黏附分子VCAM-1的表達(dá)及川芎嗪對其影響。 方法：取健康BALB/C小鼠(H-2d，MLSb)，隨機(jī)分為三組：正常組(

7、不做處理)，骨髓移植對照組(簡稱生理鹽水組)和骨髓移植+川芎嗪治療組(簡稱川芎嗪組)。BMT模型建立后，生理鹽水組和川芎嗪組分別胃飼生理鹽水(0.2ml/只，2次/天)和川芎嗪注射液(每次2mg/只，2次/天)，直至處死為止。在BMT后第7、14、21、28d頸椎脫臼處死小鼠，采用間接免疫熒光法、Westernblot方法檢測骨髓基質(zhì)細(xì)胞Endostatin、VCAM-1蛋白表達(dá)水平，RT-PCR檢測骨髓基質(zhì)細(xì)胞Endostatin、V

8、CAM-1mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：BMT后第7、14、21、28d，川芎嗪組和生理鹽水組骨髓單個核細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞EndostatinmRNA及其蛋白的表達(dá)水平均明顯低于正常組(P＜0.05或P＜0.01)，且川芎嗪組低于生理鹽水組(P＜0.05)；到BMT后第28d生理鹽水組已基本恢復(fù)正常，而川芎嗪組仍未恢復(fù)正常水平。BMT后川芎嗪組和生理鹽水組小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞VCAM-1mRNA及其蛋白表達(dá)顯著下降，隨著時間延長川芎嗪組

9、在第21、28d已恢復(fù)正常水平，但生理鹽水組仍明顯低于正常(P＜0.01或P＜0.05)，兩組之間有顯著性差異(P＜0.01)。相關(guān)分析顯示，生理鹽水組骨髓基質(zhì)細(xì)胞Endostatin和VCAM-1mRNA及其蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而川芎嗪組Endostatin和VCAM-1mRNA及其蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。 結(jié)論：川芎嗪能提高BMT小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，加快BMT后HSPC的歸巢及在骨髓中的增殖；且能通過反饋調(diào)節(jié)BMT小鼠骨

10、髓基質(zhì)細(xì)胞新血管生成抑制因子Endostatin的表達(dá)，促進(jìn)骨髓微環(huán)境的修復(fù)，加速移植后骨髓的造血重建。 第三部分ENDOSTATIN反義寡核苷酸對骨髓移植小鼠造血重建的影響 目的：Endostatin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞后觀察其在BMT小鼠骨髓造血恢復(fù)過程中的作用。 方法：以脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)染載體，轉(zhuǎn)染不同劑量的FITC標(biāo)記的Endostatin反義寡核苷酸，熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，用流式細(xì)胞儀檢測最佳

11、轉(zhuǎn)染條件時轉(zhuǎn)染率，用共聚焦顯微鏡、Westernblot和RT-PCR方法檢測最佳轉(zhuǎn)染條件下Endostatin反義寡核苷酸對Endostatin、VCAM-1mRNA及其蛋白表達(dá)水平的影響。實(shí)驗(yàn)分為4組：1正常組：未經(jīng)任何處理。2對照組：BMT組。3BMT+轉(zhuǎn)染Endostatin反義寡核苷酸組。4BMT+轉(zhuǎn)染Endostatin錯義寡核苷酸組。用PI法檢測各組細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果：以Endostatin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)

12、細(xì)胞后，EndostatinmRNA及其蛋白表達(dá)被顯著抑制(P＜0.01)，表明轉(zhuǎn)染成功。同時，Endostatin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染有效促進(jìn)了VCAM-1mRNA及其蛋白表達(dá)，而Endostatin錯義寡核苷酸對Endostatin和VCAM-1的表達(dá)基本無影響(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染Endostatin反義寡核苷酸可明顯降低骨髓基質(zhì)細(xì)胞凋亡率。 結(jié)論：Endostatin反義寡核苷酸可使骨髓基質(zhì)細(xì)胞上Endostatin的表達(dá)水