川芎嗪的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、隨著我國人口老齡化進(jìn)程加快，腦血管意外己成為我國三大死亡疾病之一，其中缺血性腦卒中約占70％～80％。中樞神經(jīng)系統(tǒng)因缺血/再灌注損傷致不同程度神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量，甚至危及生命。如何防治腦缺血/再灌注損傷，尋找有效的治療藥物及措施，促進(jìn)腦卒中后中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)，一直是生命科學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。隨著對(duì)缺血/再灌注損傷發(fā)病機(jī)制、病理生理的進(jìn)一步了解，大量動(dòng)物和臨床研究探索了預(yù)防和治療缺血性腦損傷的措施和藥物，但仍不能根本解

2、決問題。近年來，各國學(xué)者均在致力尋找一種能阻斷缺血性腦損傷的多個(gè)病理環(huán)節(jié)的新藥，中藥可通過多種途徑、多環(huán)節(jié)防治腦缺血損傷，具有良好的研究和應(yīng)用前景。川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP)具有較強(qiáng)的活血化瘀作用，廣泛用于治療腦血管疾病，取得較好臨床療效。本研究采用大鼠大腦中動(dòng)脈阻閉(MiddleCerebralArteryOcclusion，MACO)模型和PC12細(xì)胞氧糖剝奪(Oxygen-GlucoseDepriva

3、tion，OGD)模型，用分子生物化學(xué)技術(shù)，從整體動(dòng)物、細(xì)胞、蛋白和基因水平，探討川芎嗪的神經(jīng)保護(hù)治療作用及機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 第一部分川芎嗪對(duì)氧糖剝奪的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用和機(jī)制研究目的：研究川芎嗪對(duì)氧糖剝奪的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用和機(jī)制方法： 1.川芎嗪對(duì)氧糖剝奪的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用96孔板培養(yǎng)PC12細(xì)胞，分成三組：Control組為正常對(duì)照組；OGD組為氧糖剝奪/復(fù)氧模型組；TMP

4、組為川芎嗪保護(hù)組，每組8孔。TMP組復(fù)氧時(shí)，加入不同濃度(0.01，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28，2.56，5.12，10.24μmol/L)的川芎嗪，培養(yǎng)24h后進(jìn)行MTT比色測定和LDH的檢測。 PC12細(xì)胞OGD模型：取培養(yǎng)的PC12細(xì)胞，將培養(yǎng)液換成無糖DMEM培養(yǎng)液，用95％N2-5％CO2混合氣驅(qū)趕培養(yǎng)液和培養(yǎng)板中的空氣，嚴(yán)密封口后，置于37℃含95％N2-5％CO2的密閉培養(yǎng)

5、箱中，建立細(xì)胞OGD模型(模擬缺血)，4h后取出培養(yǎng)板，更換常規(guī)DMEM培養(yǎng)液，并恢復(fù)正常培養(yǎng)環(huán)境(模擬再灌注)繼續(xù)培養(yǎng)。更換正常培養(yǎng)液時(shí)，TMP組同時(shí)加入相應(yīng)濃度的川芎嗪。 2.川芎嗪對(duì)氧糖剝奪的PC12細(xì)胞損傷后超氧陰離子和過氧化氫的影響6孔板培養(yǎng)PC12細(xì)胞，分成三組：Control組為正常對(duì)照組；OGD組為氧糖剝奪/復(fù)氧模型組；TMP組為川芎嗪保護(hù)組，每組4孔。TMP組復(fù)氧時(shí)，加入0.16μmol/L川芎嗪。復(fù)氧后6h、

6、24h行抗超氧陰離子和過氧化氫測定。 3.川芎嗪對(duì)氧糖剝奪的PC12細(xì)胞損傷后Trx表達(dá)的影響6孔板培養(yǎng)PC12細(xì)胞，分成三組：Control組為正常對(duì)照組；OGD組為氧糖剝奪/復(fù)氧模型組；TMP組為川芎嗪保護(hù)組，每組4孔。TMP組復(fù)氧時(shí)，加入0.16μmol/L川芎嗪，復(fù)氧后6h、24h，RT-PCR檢測Trx-1和Trx-2的mRNA的表達(dá)水平；WesternBlotting檢測Trx-1的蛋白水平。4.川芎嗪對(duì)氧糖剝奪的P

7、C12細(xì)胞損傷后TrxR表達(dá)的影響6孔板培養(yǎng)PC12細(xì)胞，分成三組：Control組為正常對(duì)照組；OGD組為氧糖剝奪/復(fù)氧模型組；TMP組為川芎嗪保護(hù)組，每組4孔。TMP組復(fù)氧時(shí)，加入0.16μmol/L川芎嗪。復(fù)氧后6h、24h行RT-PCR檢測TrxR-1和TrxR-2的mRNA的表達(dá)水平。 5.川芎嗪對(duì)氧糖剝奪的PC12細(xì)胞損傷后AEP/Ref-1表達(dá)的影響6孔板培養(yǎng)PC12細(xì)胞，分成三組：Control組為正常對(duì)照組；O

8、GD組為氧糖剝奪/復(fù)氧模型組；TMP組為川芎嗪保護(hù)組，每組4孔。TMP組復(fù)氧時(shí)，加入0.16μmol/L川芎嗪。復(fù)氧后6h、24hWesternBlotting檢測APE/Ref-1的蛋白水平。 結(jié)果：1.川芎嗪對(duì)氧糖剝奪的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與正常對(duì)照組比，OGD組和TMP組復(fù)氧后24h，OD值均明顯降低；與OGD組比，PC12細(xì)胞在川芎嗪(0.01μmol～2.56μmol/L)濃度范圍內(nèi)，OD值均明顯升高(P＜0.0

9、5)。但隨著川芎嗪濃度繼續(xù)增大，OD值明顯降低(P＜0.05)。 與正常對(duì)照組比，OGD組和TMP組復(fù)氧后24h，培養(yǎng)液中的LDH明顯增加(P＜0.05)；與OGD組比，PC12細(xì)胞在川芎嗪(0.01μmol～2.56μmol/L)濃度范圍內(nèi)，LDH明顯減少(P＜0.05)。 2.川芎嗪對(duì)氧糖剝奪的PC12細(xì)胞損傷后超氧陰離子和過氧化氫的影響與正常對(duì)照組比，TMP組復(fù)氧后6h、24h，抗超氧陰離子能力的逐漸增強(qiáng)(P＜0.

10、05)。但OGD組在復(fù)氧后6h、24h，抗超氧陰離子能力逐漸減弱(P＜0.05)；與OGD組比，TMP組復(fù)氧后6h、24h抗超氧陰離子能力顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。 與正常對(duì)照組比，OGD組和TMP組復(fù)氧后6h、24h，H202的產(chǎn)生明顯著增加(P＜0.05)；與OGD組比，TMP組復(fù)氧后6h、24h，H2O2產(chǎn)生顯著降低(P＜0.05)。 3.川芎嗪對(duì)氧糖剝奪的PC12細(xì)胞損傷后Trx表達(dá)的影響與正常對(duì)照組比，OGD組

11、和TMP組復(fù)氧后6h、24h，Trx-1mRNA表達(dá)的顯著降低(P＜0.05)；與OGD相比，TMP組復(fù)氧后6h、24h，Trx-1mRNA表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05)。 與正常對(duì)照組比，OGD組和TMP組復(fù)氧后6h、24h，Trx-2mRNA表達(dá)的顯著降低(P＜0.05)；與OGD相比，TMP組復(fù)氧后24h，Trx-2mRNA表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05)。 與正常對(duì)照組比，OGD和TMP組復(fù)氧后6h、24h，T

12、rx-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)；與OGD組比，TMP組復(fù)氧后24h，Trx-1蛋白表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05)。 4.川芎嗪對(duì)氧糖剝奪的PC12細(xì)胞損傷后TrxR表達(dá)的影響與正常對(duì)照組比，OGD組和TMP組復(fù)氧后6h、24h，TrxR-1mRNA表達(dá)的顯著降低(P＜0.05)；與OGD相比，TMP組復(fù)氧后6h、24h，TrxR-1mRNA表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05)。 與正常對(duì)照組比，OGD組和TM

13、P組復(fù)氧后6h、24h，TrxR-2mRNA表達(dá)的顯著降低(P＜0.05)；與OGD相比，TMP組復(fù)氧后24h，TrxR-2mRNA表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05)。 5.川芎嗪對(duì)氧糖剝奪的PC12細(xì)胞損傷后AEP/Ref-1表達(dá)的影響與正常對(duì)照組比，OGD和TMP組復(fù)氧后6h、24h，AEP/Ref-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)；與OGD組比，TMP組復(fù)氧后6h，AEP/Ref-1蛋白表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05)

14、。 第二部分川芎嗪對(duì)大鼠短暫局灶性腦缺血/再灌注損傷的治療時(shí)間窗和機(jī)制研究目的：研究川芎嗪對(duì)大鼠短暫局灶性腦缺血/再灌注損傷的治療時(shí)間窗和治療作用機(jī)制方法：1.川芎嗪對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的治療時(shí)間窗40只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為5組(n=8)，對(duì)照組(即生理鹽水組)和川芎嗪治療組(T1、T2、T4、T6組)，分別于再灌注后1h、2h、4h和6h腹腔注射川芎嗪20mg/kg，每隔24h一次，共3次。建立大鼠MCAO(120

15、min)誘導(dǎo)的局灶性腦缺血模型，評(píng)估再灌注后72h時(shí)神經(jīng)功能缺陷評(píng)分(NDS)并處死動(dòng)物，取大腦行2,3,5-氯化三苯四唑(TTC)染色，以測量腦梗死容積。 2.川芎嗪對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注后Trx和TrxR表達(dá)影響10只雄性SD大鼠，隨機(jī)分成二組：對(duì)照組(即生理鹽水組)和川芎嗪組，分別于再灌注時(shí)腹腔注射生理鹽水2ml、川芎嗪20mg/kg。建立大鼠MCAO(120min)模型，再灌注后的6h、24h分別處死大鼠，RT-PC

16、R檢測Trx-1、Trx-2和TrxR-1、TrxR-2mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果：1.川芎嗪對(duì)大鼠短暫局灶性腦缺血/再灌注損傷的治療時(shí)間窗再灌注后72h，對(duì)照組的的神經(jīng)功能缺陷評(píng)分(NDS)明顯高于T1組、T2組和T4組(P＜0.05)；T1、T2、T4和T6組間神經(jīng)功能缺陷評(píng)分無差異(P＞0.05)。再灌注72h腦梗死容積，對(duì)照組(205±72.)mm3明顯大于T1組(116±44)mm3、T2組(127±30)mm3和T4

17、組(135±35)mm3(P＜0.05)，T1和T6兩組間梗死容積有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，T1、T2和T4組間腦梗死容積無明顯差異(P＞0.05)。 2.川芎嗪對(duì)大鼠短暫局灶性腦缺血/再灌注后TrxmRNA的影響①對(duì)側(cè)大腦皮層：與對(duì)照組相比，TMP組再灌注后6h、24h，Trx-1mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，而Trx-2mRNA表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 3.川芎嗪對(duì)局灶性腦缺血/再灌注后Trx