氧濃度變化對銅綠假單胞菌生物被膜生成的影響.pdf

1、背景： 銅綠假單胞菌可以引起各種急慢性感染，并且由該菌引起的院內(nèi)獲得性感染的發(fā)病率遠高于社區(qū)獲得性感染，其原因目前并未完全明確。在眾多學說中，目前認為產(chǎn)生生物被膜是銅綠假單胞菌耐藥和躲避人體免疫系統(tǒng)攻擊的重要手段之一。藻酸鹽是生物被膜的重要組成成分，在生物被膜病的發(fā)病機制中有重要作用。氧療是臨床上常用的治療方法，目前還沒有關于高氧如何影響銅綠假單胞菌產(chǎn)生生物被膜的報道。密度感應系統(tǒng)是細菌協(xié)調(diào)群體生物學效應的一種有效手段，對于細菌

2、毒力、耐藥性等方面有重要影響，但是否在生成生物被膜這種群體行為中起調(diào)控作用目前也爭議頗多。Ⅲ型分泌系統(tǒng)是銅綠假單胞菌主要的毒力因素之一，在急性感染中發(fā)揮重要作用，對于Ⅲ型分泌系統(tǒng)和生物被膜形成這兩種生物學行為的關系學術界也有一些分歧。 目的： 觀察氧環(huán)境變化對銅綠假單胞菌產(chǎn)生生物被膜及藻酸鹽的影響，并探討密度感應系統(tǒng)中Las系統(tǒng)和Rhl系統(tǒng)在生物被膜調(diào)控中的作用、以及Ⅲ型分泌系統(tǒng)表達和生物被膜形成的相互關系。 方

3、法： 1.隨機擴增DNA多態(tài)性基因分型法對23株銅綠假單胞菌臨床株進行基因型鑒定，以區(qū)別是否有來源于同一克隆的菌株。 2.23株基因型不同的銅綠假單胞菌臨床株分別在無氧(0％氧濃度)、低氧(10％)、正常氧(20％)、高氧(30％、40％、50％、60％)七個不同的氧濃度下連續(xù)培養(yǎng)3天。用結晶紫染色法檢測生物被膜產(chǎn)生量；對—羥基聯(lián)苯法測定藻酸鹽產(chǎn)生量。 3.硝酸銀染色法觀察標準菌株ATCC27853在不同氧濃度環(huán)

4、境下產(chǎn)胞外多糖的時間窗。 4.觀察ATCC27853在不同氧濃度環(huán)境下生長曲線的差異。 5.采用實時定量PCR測定23株臨床菌株在不同氧濃度環(huán)境下密度感應系統(tǒng)中信號分子合成酶調(diào)控基因LasⅠ和RhlⅠ的表達。 6.Westernblot方法觀察23株臨床菌株在不同氧濃度環(huán)境下分泌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的代表毒素——胞外酶ExoS的情況。 結果： 1.基因分型顯示23株菌株均能產(chǎn)生指紋圖譜，分型率為100％。

5、根據(jù)所得DNA片段數(shù)目及大小對銅綠假單胞菌菌株進行相似度比較，當使用隨機引物A時，菌株1、3、6、20、22的DNA擴增條帶相似，菌株4和23、8和21分別相似；其余菌株條帶均不相同；再采用引物B對菌株1、3、4、6、8、20、21、22、23DNA進行隨機擴增，結果顯示擴增條帶均不相同。 2.檢測23株臨床株分別在七種氧濃度環(huán)境下培養(yǎng)3天的生物被膜產(chǎn)生量，結果表明在氧濃度為50％時生物被膜產(chǎn)生量達到最高值(4.05OD/mg/

6、ml)，趨勢性分析表明隨著氧濃度的升高生物被膜產(chǎn)生量逐漸上升，相關性分析顯示生物被膜產(chǎn)生量與氧濃度成正相關，R為0.455，P為0.000。 3.測定23株臨床株分別在七種氧濃度環(huán)境下培養(yǎng)3天的藻酸鹽生成量，結果表明藻酸鹽產(chǎn)生量是在氧濃度為60％的條件下達到最高值(85.22ug/mg蛋白)，趨勢性分析表明隨著氧濃度的升高藻酸鹽產(chǎn)生量逐漸上升，相關性分析顯示藻酸鹽產(chǎn)生量與氧濃度成正相關，R為0.367，P為0.000。

7、4.銀染法觀察ATCC27853產(chǎn)生胞外多糖的時間窗，結果顯示在氧濃度分別為40％、50％、60％時，菌株培養(yǎng)一小時即可出現(xiàn)胞外多糖；氧濃度分別為20％、30％時，菌株需培養(yǎng)2小時以上才出現(xiàn)胞外多糖；氧濃度為10％時，胞外多糖最早出現(xiàn)時間為4小時；無氧條件下，菌株培養(yǎng)8個時出現(xiàn)胞外多糖。 5.ATCC27853生長曲線結果顯示當氧濃度分別為O％、10％、20％時，菌株培養(yǎng)3小時開始由延遲期進入對數(shù)生長期；氧濃度為30％時，培養(yǎng)2

8、小時進入對數(shù)生長期；氧濃度為40％、50％、60％時，菌株培養(yǎng)1小時即進入對數(shù)生長期。 6.實時定量PCR結果顯示相關性分析未見LasⅠ、RhlⅠ的表達和氧濃度(R分別為0.025和-0.044，P大于0.05)、對應菌株生物被膜產(chǎn)生量(R分別為0.001和0.11，P大于0.05)、藻酸鹽產(chǎn)生量(R分別為0.029和0.193，P大于0.05)有統(tǒng)計學意義。 7.Westernblot結果表明菌株1、2、3、4、5、7

9、、8、9、10、15、16、19、23共13株菌在氧濃度為20％條件下分泌胞外酶ExoS；當氧濃度為10％時，只有菌株15、16能夠分泌ExoS；當氧濃度為30％時，菌株1、2、4、5、9、10、15能夠分泌ExoS；氧濃度為0％、40％、50％、60％的條件下均未見菌株分泌ExoS。 結論： 1.銅綠假單胞菌在高氧環(huán)境下更容易產(chǎn)生生物被膜，且隨著環(huán)境氧濃度的升高，生物被膜和藻酸鹽產(chǎn)生量增加，表明高氧促進了銅綠假單胞菌產(chǎn)

10、生生物被膜的能力，從而有利于銅綠假單胞菌在人體內(nèi)的耐藥和寄植，不利于肌體對病原菌的清除和抗生素殺菌作用的發(fā)揮，所以針對有銅綠假單胞菌感染高危因素的患者應該避免過高濃度的氧療。 2.在不同氧濃度環(huán)境下雖然銅綠假單胞菌產(chǎn)生生物被膜的能力有顯著差異，但是生物被膜形成的早期密度感應系統(tǒng)中Las系統(tǒng)和Rhl系統(tǒng)關鍵基因表達無明顯趨勢性變化，因此Las系統(tǒng)和Rhl系統(tǒng)可能在生物被膜形成早期階段因為菌群數(shù)量處于低水平而未參與生物被膜的調(diào)控過程