大蒜素對銅綠假單胞菌生物被膜的干預(yù)作用及機(jī)制初步研究.pdf

1、第一部分大蒜素對銅綠假單胞菌生物被膜早期黏附及胞外多糖的影響 目的：研究大蒜素對銅綠假單胞菌PAO1菌株生物被膜（biofilm，BF）早期黏附及胞外多糖復(fù)合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）的影響，。 方法：利用熒光多功能酶標(biāo)儀檢測各組不同時間96孔板中pGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化PAO1菌株的熒光強(qiáng)度，通過計(jì)算黏附率以表示大蒜素對不同時間點(diǎn)細(xì)菌黏附的影響；利用熒光顯微鏡下定性觀察細(xì)

2、菌的黏附量；應(yīng)用異硫氰酸標(biāo)記的刀豆蛋白A（FITC conjugated concanavalin A，F(xiàn)ITC-conA）特異性結(jié)合細(xì)菌EPS，熒光顯微鏡下定性觀察各組EPS的變化；利用硫酸-苯酚法定量各組細(xì)菌EPS的產(chǎn)量。 結(jié)果：6小時組，大蒜素高濃度干預(yù)后細(xì)菌的黏附率由（0.70±0.03）下降至（0.50±0.01），t=15.014，P<0.05，大蒜素低濃度干預(yù)后黏附率也有下降，但不及高濃度組明顯；除了9小時組其他時

3、間組趨勢與6小時組大致相似，可能與大蒜素不穩(wěn)定性有關(guān)。熒光顯微鏡觀察可見生理鹽水對照組細(xì)菌菌落分布，干預(yù)組黏附的細(xì)菌稀疏散在分布，以高濃度為甚。FITC-conA可顯色胞外多糖，在熒光顯微鏡下觀察可見大蒜素干預(yù)后EPS減少，稀??；EPS定量實(shí)驗(yàn)，大蒜素高濃度干預(yù)組EPS總量（181.19±1.59）μg較生理鹽水對照組（602.66±21.94）μg有明顯降低，t=60.589，P<0.05。 結(jié)論：大蒜素可顯著減少PAO1菌株

4、黏附及產(chǎn)EPS的能力。 第二部分大蒜素對銅綠假單胞菌生物被膜形成過程的影響及結(jié)構(gòu)定量化分析 目的：利用激光共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM）觀察大蒜素對銅綠假單胞菌PAO1菌株生物被膜（biofilms，BF）形成過程的影響，并用ISA（Image Structure Analyzer）軟件對BF結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量化分析。 方法：體外建立1d，3d，7d組PA

5、O1菌株BF模型，每組分3小組，分別于生理鹽水、大蒜素128μg/ml、大蒜素10μg/ml作用6小時。通過熒光探針SYTO9/PI標(biāo)記，利用CLSM進(jìn)行動態(tài)觀察，并用ISA軟件對其BF結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析。 結(jié)果：（1）生理鹽水對照組1d，3d，7d的厚度分別為12.94±0.55μm，23.98±0.99μm，28.83±3.67μm，可見厚度隨時間的增加而增加，但在后3d增加的速度減慢；同時區(qū)域孔率（Areal Porosit

6、y，AP）各時間組分別為0.89±0.01，0.85±0.02，0.76±0.10，呈下降趨勢，；平均擴(kuò)散距離（Average Diffusion Distance，ADD）有逐漸增加趨勢，各時間組分別為1.68±0.13，1.71±0.08，2.54±0.33；結(jié)構(gòu)熵（Textural Entropy，TE）有增加的趨勢，各時間組分別為5.62±0.89，6.15±0.82，6.78±0.0.93。（2）7d組模型中，大蒜素128μg

7、/ml作用后，BF厚度由（28.83±0.67）μm減少到（16.50±0.69）μm；AP由（0.76±0.10）增加到（0.92±0.02）；TE由（6.78±0.93）減少到（5.33±0.43）。10μg/ml大蒜素干預(yù)后，有同樣趨勢，但效應(yīng)不如高濃度明顯。（3）1d，3d模型組，大蒜素作用后同對照組相比：厚度，AP，TE的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，趨勢同7d組。 結(jié)論：ISA軟件可以對大蒜素對PAO1菌株BF形

8、成的影響進(jìn)行結(jié)構(gòu)定量分析，大蒜素對各個時間段BF的形成均有影響，高濃度128μg/ml，效果更顯著。 第三部分大蒜素聯(lián)合環(huán)丙沙星的抗菌作用及對銅綠假單胞菌生物被膜的影響 目的：通過體外構(gòu)建銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物被膜（biofilms，BF）模型，研究大蒜素聯(lián)合環(huán)丙沙星的體外抗菌作用及對銅綠假單胞菌BF的影響。 方法：采用棋盤法設(shè)計(jì)，微量肉湯稀釋法測定，測定不同濃度組合的抗

9、菌藥物對銅綠假單胞菌最低抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration MIC），并計(jì)算部分抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）指數(shù)，判定聯(lián)合效應(yīng)。FIC指數(shù)<0.5，協(xié)同作用；0.54，拮抗作用；并利用甲基四氮唑藍(lán)（3-[4，5-dimethyl-2-th

10、iazolyl]-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT）活菌計(jì)數(shù)法和熒光顯微鏡考察聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物對銅綠假單胞菌生物被膜的影響。 結(jié)果：大蒜素與環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用后，兩者M(jìn)IC顯著降低，F(xiàn)IC指數(shù)為0.2578125；1/2、1/4 MIC的大蒜素可顯著增加1/2、1/4 MIC的環(huán)丙沙星對銅綠假單胞菌生物被膜的抑菌活性，玻片上活細(xì)菌明顯減少，單獨(dú)應(yīng)用兩種抗生素仍以菌落分布為主；與生理鹽水

11、對照組大致相當(dāng)。 結(jié)論：大蒜素與環(huán)丙殺星聯(lián)合應(yīng)用后，對銅綠假單胞菌BF表現(xiàn)為協(xié)同作用。 第四部分大蒜素對銅綠假單胞菌群體密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控毒力因子表達(dá)的影響 目的：通過體外測定銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）群體密度感應(yīng)（Quorum Sensing，QS）系統(tǒng)調(diào)控的毒力因子的表達(dá)，比較大蒜素干預(yù)前后毒力因子表達(dá)的差異以及對銅綠假單胞菌PAO1成熟BF的影響。 方法：應(yīng)用ELIS

12、A的方法，比較處理前后外毒素A的含量差異；利用彈性蛋白-剛果紅染色的方法，測定處理前后彈性蛋白酶活性；用蒽酮-硫酸法測定鼠李糖脂，測定波長553nm；熒光酶標(biāo)儀檢測青膿素含量變化；利用激光共聚焦觀察干預(yù)前后對銅綠假單胞成熟BF的影響。 結(jié)果：大蒜素干預(yù)后與生理鹽水對照組比較，外毒素A、彈性蛋白酶、鼠李糖脂和青膿素表達(dá)分別由（19.630±0.573）pg/μl、（0.467±0.003）、（2.009±0.063）g/L、（93

13、25.833±367.675）下降到（6.529±0.289）pg/μl、（0.032±0.001）、（0.269±0.009）g/L、（7819.167±111.800）。激光共聚焦觀察可見生理鹽水對照組可見細(xì)菌密集，BF表面粗燥不平，層疊如集云狀，BF厚度較厚29μm左右，大蒜素120μg/ml干預(yù)下，BF厚度有明顯減少，約18μm左右，縱切面見呈扁平狀，結(jié)構(gòu)較稀疏，細(xì)菌散在分布。 結(jié)論：大蒜素可抑制銅綠假單胞菌群體密度感應(yīng)