甲型副傷寒STF口服制劑的制備和檢定.pdf

1、目的：初步研制一種用于緊急預防和輔助治療甲型副傷寒的新型生物制劑，并探索其制備工藝。
　　 方法：(1)體內(nèi)免疫法制備甲型副傷寒特異性轉移因子(PA-STF):制備甲型副傷寒沙門菌(SPA)免疫原，采取皮下多點注射免疫山羊，免疫成功后分別取脾臟和淋巴結制備PA-STF。(2)體外免疫法制備PA-STF:采用SPA體外免疫脾細胞技術，探索PHA刺激的合適劑量、免疫原最佳濃度及最佳作用時間、免疫羊脾細胞最適培養(yǎng)時間，按優(yōu)化條件培養(yǎng)羊

2、脾細胞，制備PA-STF。(3) PA-STF的理化性質檢定：采用紫外分光光度計進行多波長掃描，以苔黑酚法和改良Lowry法分別檢測PA-STF的核糖及多肽含量，并進行無菌試驗、熱原質試驗和安全試驗等。(4) PA-STF的免疫學活性檢定：取昆明小鼠，隨機分成實驗1組、實驗2組、對照1組、對照2組和NS組，分別以體內(nèi)法制備的PA-STF、體外法制備的PA-STF、體內(nèi)法制備的非特異性轉移因子(nTF)、體外法制備的nTF、生理鹽水灌胃，

3、采用淋巴細胞增殖試驗、白細胞粘附抑制試驗(LAIT)、吞噬細胞吞噬功能試驗、吞噬細胞殺菌功能試驗和免疫保護性試驗等檢定PA-STF的免疫學活性。免疫保護性試驗中，SPA攻擊后第4天仍然存活的小鼠，取5只觀察攻擊后2周時的一般情況，剩余小鼠在攻擊后第7天處死，剪取3cm的回腸用4%甲醛固定后，HE染色，鏡檢，觀察腸粘膜的病理學改變。
　　 結果：(1)以淋巴結制備的PA-STF的多肽濃度為1.83±0.17mg/ml，核糖濃度為0

4、.572±0.024mg/ml，以脾臟制備的PA-STF的多肽濃度為1.59±0.22 mg/ml，核糖濃度為0.493±0.015mg/ml，兩者相比，多肽之間及核糖之間濃度沒有顯著差異(P>0.05)。(2)100μg/ml的PHA與脾細胞培養(yǎng)6h后，加入0.2ng/ml的SPA免疫原，繼續(xù)培養(yǎng)至96h條件下制備的PA-STF的多肽和核糖的含量，明顯高于其他劑量、時間等條件下制備的PA-STF(P<0.05)。(3)兩種方法制備的P

5、A-STF的氨基酸、多肽、核糖的含量無顯著性差異(P>0.05)，無菌試驗均為陰性，熱原質試驗和安全試驗均合格。(4)兩種方法制備的PA-STF在多肽濃度為0.60mg/ml時，對淋巴細胞的刺激指數(shù)(SI)明顯高于其它濃度時的SI(P<0.05)；兩實驗組的LAIR均高于兩對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；兩實驗組之間比較，LAIR無顯著性差異(P>0.05)；吞噬細胞的吞噬功能和殺菌功能試驗中，實驗組與對照組之間以及兩實驗組之

6、間比較，吞噬率和殺菌率均無顯著性差異(P>0.05)，各組吞噬率與殺菌率的相關系數(shù)均大于0.8；免疫保護性試驗中，兩實驗組分別與兩對照組比較，實驗組小鼠存活率均明顯高于對照組(P<0.05)，兩實驗組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗組存活小鼠2周時一般情況明顯好于其它組，且病理學結果顯示小鼠回腸粘膜的炎性程度較其它組輕。
　　 結論：(1)體內(nèi)免疫法成功制備PA-STF，脾臟和淋巴結均可作為制備原料；體外免疫法成功制備