CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞在葡萄膜炎患者中的表達(dá)及其意義的初步研究.pdf

1、目的：
　　葡萄膜炎是常見的眼科疾病，是一組可累及葡萄膜、視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜血管及玻璃體的炎性病變，常累及雙眼，易于反復(fù)發(fā)作，是致盲的常見疾病。由于其病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜不清，目前尚無理想的治療方法。近年來，隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，人們?nèi)找嬲J(rèn)識到葡萄膜炎是一種器官特異性自身免疫病，越來越多的研究證實(shí)免疫學(xué)機(jī)制在其發(fā)病中占到重要作用。一般認(rèn)為，多種葡萄膜炎被認(rèn)為是針對特定眼部蛋白的抗原特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)，其中T細(xì)胞在葡萄

2、膜炎發(fā)病中可能起到中心作用。多種細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-1、TGF-β、趨化因子及其受體等也參與了葡萄膜炎的發(fā)病。但目前關(guān)于其具體發(fā)病機(jī)制研究還不是很清楚，進(jìn)一步研究其免疫學(xué)發(fā)病機(jī)理并探討新的免疫學(xué)治療方法對于葡萄膜炎有重要意義。
　　CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的亞群之一，可通過抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)、抑制傳統(tǒng)T細(xì)胞的活化以及促進(jìn)一些抑制性細(xì)胞因子的分泌等，在維持機(jī)自身免疫性疾

3、病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。目前CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞在葡萄膜炎中表達(dá)及作用的研究主要集中在在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎（EAU）動物模型中。多項(xiàng)研究表明，CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞在EAU中發(fā)揮重要作用，過繼轉(zhuǎn)移這種細(xì)胞給EAU小鼠能起到治療作用，為葡萄膜炎的治療提供了一種新的思路。但是，目前有關(guān)CD4+CD25+細(xì)胞在葡萄膜炎患者中的表達(dá)及其作用研究較少。
　　因此，我們實(shí)驗(yàn)旨在：1.通過檢測不同病情程度葡萄膜炎患者外

4、周血中CD4+CD25highTreg細(xì)胞的表達(dá)水平，初步探討CD4+CD25highTreg細(xì)胞在葡萄膜炎發(fā)病中的作用；2.通過同時檢測CD4+細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ、TNF-α及IL-10細(xì)胞因子及其單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的表達(dá)，并分析其表達(dá)與CD4+CD25high調(diào)節(jié)T細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步研究葡萄膜炎免疫學(xué)發(fā)病機(jī)理，并初步探討CD4+CD25highTreg細(xì)胞在葡萄膜炎的發(fā)病中可能起到調(diào)節(jié)作用的機(jī)理。
　　方法：

5、
　　1．選取正常健康對照16例及病情活動期葡萄膜炎患者30例，按照不同分類將其總結(jié)，并記錄血沉等炎癥指標(biāo)，按照評分標(biāo)準(zhǔn)將病情評分。
　　2．用三色免疫熒光染色方法、流式細(xì)胞術(shù)分析，對葡萄膜炎患者及對照外周血細(xì)胞表面CD4、CD25、及CTLA-4的表達(dá)進(jìn)行檢測，分析CD4+CD25hig在CD4+中表達(dá)比例及其CD4+CD25highCTLA-4+細(xì)胞的表達(dá)。而且，將其與不同類型、不同病情嚴(yán)重程度患者進(jìn)行相關(guān)分析。

6、　　3．用細(xì)胞內(nèi)免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)方法，檢測CD4+細(xì)胞內(nèi)胞內(nèi)因子IFN-γ、TNF-α及IL-10的表達(dá)，分析其相互之間、與病情嚴(yán)重程度及與細(xì)胞表面CD4+CD25high表達(dá)的相關(guān)性。并采用ELISA方法，檢測葡萄膜炎患者外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α及IL-10的表達(dá)，分析其與病情嚴(yán)重程度及其細(xì)胞表面CD4+CD25high表達(dá)的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1．葡萄膜炎患者外周血中CD4+CD25

7、highT細(xì)胞的百分率與正常健康對照（8.56±4.22％vs.5.72±3.11％）相比，顯著升高(P=0.022)，而且與患者病情嚴(yán)重程度明顯正相關(guān)（P=0.007）。但不同類型葡萄膜炎患者之間表達(dá)無明顯差異（P>0.05）。另外，CD4+CD25highCTLA4+T細(xì)胞在葡萄膜炎患者外周血中比例較正常對照明顯升高（P=0.012）。
　　2．葡萄膜炎患者外周血中IFN-γ在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)陽性百分率為7.02±4.8

8、6％，與正常健康對照（4.19±3.38％）相比顯著升高(P=0.026)。葡萄膜炎患者外周血中TNF-α+細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)陽性百分率為10.22±5.61％，較正常健康對照（6.75±4.18％）顯著升高(P=0.023)。IL-10+在葡萄膜炎患者CD4+細(xì)胞內(nèi)表達(dá)比例較正常健康對照略高，但統(tǒng)計上無顯著性差異。
　　3．這三種胞內(nèi)細(xì)胞因子在CD4+細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與患者病情嚴(yán)重程度均有顯著相關(guān)性（P<0.05），而且相

9、互之間均明顯相關(guān)（P<0.05）。同時發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-10分別與CD4+CD25high在外周血的表達(dá)均有明顯相關(guān)性（P<0.05）。
　　4．ELISA方法發(fā)現(xiàn)葡萄膜炎患者外周血淋巴細(xì)胞分泌上清中IFN-γ、TNF-α的表達(dá)與正常健康對照相比均明顯升高（P<0.05），且與病情明顯有相關(guān)性（P<0.05）。IL-10雖在葡萄膜炎患者外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)水平較健康對照略高，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。
　

10、　結(jié)論：
　　1.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：葡萄膜炎患者外周血中CD4+CD25high的比例顯著高于健康對照組，同時，與Treg細(xì)胞密切相關(guān)的CTLA-4同樣被發(fā)現(xiàn)在葡萄膜炎患者CD4+CD25highTreg細(xì)胞中高表達(dá)，初步提示CD4+CD25+Treg可能在葡萄膜炎的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，并與疾病的活動密切相關(guān)。
　　2.建立細(xì)胞內(nèi)胞內(nèi)因子表達(dá)檢測體系，證實(shí)在葡萄膜炎患者外周血CD4+細(xì)胞中細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α表達(dá)較正常

11、健康對照升高，可能作為重要的致炎因子參與葡萄膜炎發(fā)病。葡萄膜炎患者外周血CD4+細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-10的表達(dá)與CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞表達(dá)有一定相關(guān)性，也初步提示這些細(xì)胞因子與CD4+CD25high的關(guān)系，可能受其調(diào)控。
　　3.上述實(shí)驗(yàn)體系的建立，為我們的進(jìn)一步深入研究葡萄膜炎中CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的具體作用機(jī)理提供了很好的保障，其結(jié)果為進(jìn)一步揭示葡萄膜炎的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)理，并且進(jìn)一步探討葡萄膜炎新的免疫學(xué)治療