胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制.pdf

1、第一部分胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素體外誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞分化功能的影響及機(jī)制
　　目的:研究體外氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞分化功能的影響和機(jī)制。
　　方法:培養(yǎng)血管人平滑肌細(xì)胞(HVSMC),經(jīng)PBS(對(duì)照組)或氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)(實(shí)驗(yàn)組)刺激24小時(shí)后,ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TSLP的濃度。分離并培養(yǎng)人樹突狀細(xì)胞(DCs)與初始CD4+T細(xì)胞。人D

2、Cs與上述培養(yǎng)上清或PBS共孵育24小時(shí)后,去除上清,收集細(xì)胞。DCs在加入抗TSLP中和抗體(TSLP抗體組)或?qū)φ罩泻涂贵w(對(duì)照抗體組)的Transwell系統(tǒng)中與初始CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)5天后,加入抗CD3抗體孵育24小時(shí)后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞比例,ELISA方法檢測(cè)上清Th17細(xì)胞因子(IL-17、IL-22及TNF-α)表達(dá)。
　　結(jié)果:與對(duì)照組Th17細(xì)胞(0.87±0.22)％相比較,實(shí)驗(yàn)組Th17細(xì)胞比例明

3、顯增加(9.88±2.16)%(P<0.001);與對(duì)照中和抗體組Th17細(xì)胞(9.25±1.83)%相比較,TSLP中和抗體組能明顯抑制ox-LDL誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞(3.42±1.15)%(P<0.001)。與PBS對(duì)照組IL-17(107.53±38.69)pg/ml、IL-22(1.51±0.21)pg/ml和TNF-α(0.26±0.02)pg/ml相比較,ox-LDL實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-17(792.17±9.67)pg

4、/ml(P<0.001)、IL-22(7.43±0.95)pg/ml(P<0.01)和TNF-α(3.54±0.35)pg/ml(P<0.001)水平明顯增加;與對(duì)照組中和抗體組細(xì)胞上清IL-17(744.05±65.64)pg/ml、IL-22(6.37±0.64)pg/ml和TNF-α(3.43±0.21)pg/ml相比較,TSLP中和抗體組細(xì)胞上清IL-17(390.22±47.33)pg/ml(P<0.001)、IL-22(3.

5、85±0.71)pg/ml(P<0.001)和TNF-α(2.38±0.32)pg/ml(P<0.01)。
　　結(jié)論:Ox-LDL體外誘導(dǎo)人血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生TSLP可誘導(dǎo)DCs促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞亞群分化。
　　第二部分胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞抗原提呈功能及炎性分泌功能的影響
　　目的:研究胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞抗原提呈能力及炎性分泌功能的影響和可能作用機(jī)制。

6、　　方法:分離野生型C57B小鼠及TSLPR基因敲除(TSLPR-/-)C57B小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,給予TSLP進(jìn)行刺激。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞MHCⅡ、CD86的表達(dá);采用實(shí)時(shí)定量PCR以及ELISA方法檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)以及培養(yǎng)上清液炎癥因子MCP-l、TNF-α、IL-10的表達(dá)。
　　結(jié)果:與野生型對(duì)照組比較,野生型實(shí)驗(yàn)組小鼠巨噬細(xì)胞表面抗原提呈分子(MHCⅡ,CD86)表達(dá)明顯升高,炎癥因子MCP-1、TNF-α表達(dá)及

7、分泌均增高,IL-10表達(dá)及分泌無(wú)明顯變化;與TSLPR基因敲除對(duì)照組相比較,TSLPR基因敲除小鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)TSLP刺激后細(xì)胞表面抗原提呈分子(MHCⅡ,CD86)表達(dá)及炎癥因子(MCP-1、TNF-α和IL-10)的表達(dá)及分泌均無(wú)明顯變化;與野生型實(shí)驗(yàn)組相比較,TSLPR基因敲除可明顯抑制TSLP誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞抗原提呈分子增加以及炎癥因子表達(dá)。
　　結(jié)論:TSLP可通過(guò)與TSLPR結(jié)合促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞活化,增加巨噬細(xì)胞抗原

8、遞呈能力,產(chǎn)生炎癥因子,促使小鼠巨噬細(xì)胞向促炎巨噬細(xì)胞表型M1型轉(zhuǎn)化。
　　第三部分胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素在氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的pyroptosis中的作用
　　目的:研究胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞pyroptosis的作用和機(jī)制。
　　方法:分離、培養(yǎng)人單核巨噬細(xì)胞ox-LDL(100ug/ml)共培養(yǎng)48小時(shí)。采用Westernblot及酶底物方法檢測(cè)活化型天

9、冬半胱氨酸酶-1(caspase-1)的表達(dá);采用LDH流出及CalceinAM/EthDⅢ檢測(cè)細(xì)胞死亡,TUNEL熒光染色檢測(cè)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞,ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞因子因子IL-1β及IL-18的表達(dá)。給予非特異性caspase-1阻斷劑、特異性caspase-1阻斷劑、TSLP中和抗體或?qū)φ罩泻涂贵w后,檢測(cè)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后上述指標(biāo)的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.與PBS對(duì)照組比較,ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表

10、達(dá)活化型caspase-1。
　　2.LDH流出及CaceinAM/EthDⅢ檢測(cè)表明與PBS對(duì)照組比較,ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞死亡;TUNEL染色表明與PBS對(duì)照組比較,ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增加;ELISA表明與PBS對(duì)照組比較,ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-1β及IL-18水平增高。
　　3.與非特異性caspase-1阻斷劑相比較,特異性caspase-1阻斷劑能夠顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)