PCR技術(shù)在黑木耳交配型因子研究中的應(yīng)用.pdf

1、黑木耳(Auriculariaauricula)是一種栽培歷史悠久，深受消費(fèi)者歡迎的食用菌，具有重要的藥用滋補(bǔ)功能。 采用原生質(zhì)體單核化技術(shù)分別獲得黑木耳栽培菌株He-1和Ju-1的單核體H2和J3，H2和J3雜交配對(duì)形成雙核體H2J3。H2J3經(jīng)栽培出耳后，獲得其子實(shí)體，通過單孢分離技術(shù)獲得F1子代59個(gè)單核體。 根據(jù)交配型將F1代單核體菌株分成兩個(gè)群(A1和A2)，在每群內(nèi)各抽出10個(gè)菌株分別組成A1和A2兩個(gè)等基因

2、池。同時(shí)根據(jù)高等真菌中信息素前體羧端的CAAX模體及A座位同源結(jié)構(gòu)域中保守氨基酸序列設(shè)計(jì)了176種特異性單引物。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，僅引物XY161可以擴(kuò)增得到一條僅在A1池中出現(xiàn)的特異標(biāo)記帶XY1611462。將該特異帶克隆、測(cè)序，分析其序列結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該標(biāo)記極可能位于信息素基因的下游端；利用BLAST程序搜索同源序列，沒有比對(duì)出同源的DNA序列，但其蛋白質(zhì)序列比對(duì)出同源結(jié)構(gòu)域，表明該標(biāo)記片段可能編碼短鏈脫氫酶，表現(xiàn)出與糙皮側(cè)耳(P

3、leurotusostreatus)和新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)等異宗結(jié)合擔(dān)子菌類似的特征。該結(jié)果表明交配型座位內(nèi)的DNA序列變化較大，但其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)類似。 根據(jù)裂褶菌STE3信息素受體中的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物br1-F和br1-R，可以在親本菌株H2和24個(gè)F1子代單株中擴(kuò)增得到一條811bp的特異帶，其中包括F1代9個(gè)H2型單株(占供試菌株的15.3％)和15個(gè)J3型菌株(占供

4、試菌株的25.4％)。將在H2型菌株59號(hào)和J3型菌株45號(hào)中擴(kuò)增得到的特異帶進(jìn)行克隆和測(cè)序，運(yùn)用BLAST搜索同源序列，其DNA序列比對(duì)不出同源序列，但其蛋白質(zhì)序列可以比對(duì)出同源結(jié)構(gòu)域——STE3信息素受體，總共搜索到92個(gè)同源序列，e值大小從2e-35到8.1；BLAST搜索結(jié)果表明，該信息素受體片段更加類似于四極性擔(dān)子菌。序列分析發(fā)現(xiàn)，該片段可能包含4個(gè)內(nèi)含子。SOSUI程序預(yù)測(cè)該片段編碼的蛋白質(zhì)是具有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。該信

5、息素受體基因片段在子代中表現(xiàn)了極高的重組率，表明該信息素受體基因因與交配型無關(guān)，從而表現(xiàn)為不連鎖，該結(jié)果與二極性食用菌滑菇(Pholiotanameko)類似。 MIP基因與多種同擔(dān)子菌(Homobasidiomycete)的A交配型座位緊密連鎖，根據(jù)MIP蛋白(Mitochondrialintermediatepeptidase)設(shè)計(jì)了6對(duì)簡(jiǎn)并引物。MIP系列引物可以在多種同擔(dān)子菌中擴(kuò)增出特異帶，而在異擔(dān)子菌(Heteroba