Ⅳ型膠原酶抑制劑的篩選及活性研究 第一部分 間接ELISA法Ⅳ型膠原酶抑制劑篩選模型的應(yīng)用及熒光底物法Ⅳ型膠原酶抑制劑篩選模型的建立;第二部分 H25抑制HT1080細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移活性的體外評(píng)價(jià)及抗侵襲作用機(jī)理的初步探討;第三部分 微生物多糖1519.pdf

1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)因其在腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成等多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要作用而成為腫瘤治療研究中引人注目的靶點(diǎn)。Ⅳ型膠原酶作為MMPs家族中的重要成員之一，可以通過(guò)降解Ⅳ型膠原等膠原底物破壞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的完整性，從而有利于腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成。一般來(lái)說(shuō)，在腫瘤細(xì)胞及其鄰近的間質(zhì)組織中，Ⅳ型膠原酶的表達(dá)和活化顯著增加，并且這種增加與腫瘤的惡性表型呈正相關(guān)。以其為分子靶點(diǎn)，發(fā)展的多種小分子Ⅳ型膠原酶抑制劑在惡性腫瘤的治療中

2、顯示出確切的療效。本論文利用兩種Ⅳ型膠原酶抑制劑篩選模型尋找活性天然產(chǎn)物及化合物。從活性微生物發(fā)酵液中分離得到了兩個(gè)大分子多糖。對(duì)篩選得到的喹諾酮類化合物進(jìn)行了體外腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的抑制活性評(píng)價(jià)。 第一部分間接ELISA法Ⅳ型膠原酶抑制劑篩選模型的應(yīng)用及熒光底物法Ⅳ型膠原酶抑制劑篩選模型的建立 根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制單抗3D6與Ⅳ型膠原酶結(jié)合的化合物可能具有Ⅳ型膠原酶抑制活性的假設(shè)，采用間接ELISA的方法建立了Ⅳ型膠原酶

3、抑制劑的高通量篩選模型。在使用間接ELISA法在大量的微生物產(chǎn)物和化合物中篩選Ⅳ型膠原酶抑制劑的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)該模型與明膠酶譜檢測(cè)之間缺乏很好的平行性。為此，建立了熒光底物法的Ⅳ型膠原酶抑制劑篩選模型。該模型機(jī)理是，MMP對(duì)小肽底物的水解解除了Dnp對(duì)Try熒光核的熒光淬滅作用，熒光值的變化反映了MMP酶解能力的強(qiáng)弱，從而可以定量評(píng)價(jià)樣品對(duì)MMP酶活性的抑制能力。對(duì)該模型的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，使之符合高通量篩選的要求。利用熒光底物模型對(duì)在

4、幾個(gè)間接ELISA法模型上的陽(yáng)性化合物和多糖進(jìn)行了活性評(píng)價(jià)和比較，結(jié)果顯示與明膠酶譜檢測(cè)的平行性較好，初步證明了模型的有效性。 第二部分H25抑制HT1080細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移活性的體外評(píng)價(jià)及抗侵襲作用機(jī)理的初步探討 喹諾酮類化合物H25是從間接ELISA法Ⅳ型膠原酶抑制劑篩選模型中篩選得到的，在熒光底物法模型中也表現(xiàn)出很好的活性，明膠酶譜檢測(cè)證明其有競(jìng)爭(zhēng)性抑制Ⅳ型膠原酶的作用。本論文中，多方面評(píng)價(jià)了H25的體外抗腫瘤細(xì)

5、胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的活性，并探討了其抗侵襲作用可能的機(jī)理。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，H25對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的增長(zhǎng)抑制作用，并具有明顯的抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H25可能是在轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞MMP-2和9的抑制。其明確的作用靶點(diǎn)尚有待更深入的研究。 第三部分微生物多糖1519A和3748A的分離 1519A和3748A，是從真菌1519和3748發(fā)酵液中分離得到的大分子多糖。它們是通過(guò)間接ELISA法Ⅳ型膠原