拉莫三嗪對腦出血大鼠前腦NR1，GluR2表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的 腦出血的病理生理學(xué)變化是一相當(dāng)復(fù)雜的過程，涉及血腫的占位性損害、血液成分及其裂解產(chǎn)物的毒性損害，以及興奮性氨基酸(EAA)的毒性作用等不同作用機(jī)制而引起的損傷級聯(lián)反應(yīng)，該反應(yīng)大都從興奮毒性開始，興奮毒性是下游事件的觸發(fā)者，是腦細(xì)胞缺血后損傷最關(guān)鍵，最重要的環(huán)節(jié)，其中，興奮性氨基酸受體NMDA(N-甲基-D-門冬氨酸)的亞基NR1的激活是興奮毒性的核心，因NR1可以直接或間接啟動電壓依賴性通道，引起Ca<'2+>大量內(nèi)

2、流，造成遲發(fā)性的神經(jīng)元變性壞。而興奮性氨基酸受體AMPA(a-氨基3-羥基5-甲基4-異惡唑丙酸)的亞基GluR2主要是抑制Ca<'2+>內(nèi)流發(fā)揮腦保護(hù)作用。 拉莫三嗪(LTG)主要用于難治性癲癇的治療，近年來發(fā)現(xiàn)其有拮抗EAA興奮性毒性作用，具體機(jī)制仍不太清楚。目前國內(nèi)外有關(guān)腦出血后NRl、GluR2的對比變化，以及與LTG相結(jié)合對神經(jīng)元的保護(hù)與損傷機(jī)制的文獻(xiàn)尚無報道。本實驗通過建立大鼠腦出血模型，采用免疫組織化學(xué)法、干濕重法

3、分別檢測血腫周圍、皮質(zhì)處不同時間點NRl、GluR2的表達(dá)及腦組織含水量的動態(tài)變化，以及LXG對NR1、GluR2、腦水腫三者的干預(yù)情況。以探討NR1、GluR2、LTG對神經(jīng)元的保護(hù)與損傷機(jī)制，為研究EAA的興奮性毒性提供實驗依據(jù)、治療及思路。 材料與方法 1．實驗動物和分組健康成年雄性Wistar大鼠72只，體重220～250g，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SYK2006-11。隨機(jī)分為組8只，手術(shù)組32只

4、，治療組32只。后兩組又分為12h、1d、3d、7d四個時間點進(jìn)行HE染色、免疫組織化學(xué)染色和腦組織含水量檢測，每組每個時間點為8只大鼠。 2．腦出血模型的制作和成功的標(biāo)志大鼠經(jīng)10﹪水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于立體定位儀上，用微量進(jìn)樣器由股動脈抽取血液50μL緩慢注入尾狀核位置，留針15min。對照組注入等量生理鹽水。動物麻醉清醒后，參照Zea longa等評分標(biāo)準(zhǔn)，累積1分以上為成功模型。 3．

5、組織切片的制備實驗大鼠斷頭取腦后，冠狀面切取針道后約3mm厚的腦片。常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋制成4μ m切片，進(jìn)行蘇木精．伊紅(HE)染色和免疫組化檢測。 4．指標(biāo)檢測 4．1 HE染色：光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理變化。 4．2 NR1、GluR2進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，采用SP法，嚴(yán)格按試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。陽性細(xì)胞的胞膜或胞漿被染成棕黃色。 5．圖像分析 每只大鼠連續(xù)切片，每5張抽取一

6、張切片，對其選取5個不同區(qū)域進(jìn)行高倍鏡(400×)觀察，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對陽性區(qū)面積平均積分光密度進(jìn)行定量分析。 6．腦組織含水量的測定實驗大鼠斷頭取腦后，取進(jìn)針道前約3mm厚的腦組織。用電子天平先稱取濕重，電熱恒溫培養(yǎng)干燥兩用箱100℃烘烤48h，再稱取干重。利用腦組織含水量=(濕重．干重)/濕重×100﹪進(jìn)行計算。 7．統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)以x±s表示，計數(shù)資料組間比較用方差分析重復(fù)測量法，數(shù)據(jù)處理采用SPSS12．0

7、軟件進(jìn)行分析。以a=0.05作為顯著性檢驗水準(zhǔn)。 1．腦組織形態(tài)學(xué)的改變手術(shù)組組織切片HE染色，腦出血后12h、1d時可見血腫周圍、皮質(zhì)處神經(jīng)細(xì)胞稀疏，胞體腫脹，3d時表現(xiàn)最明顯，細(xì)胞變形壞死，胞漿紅染明顯加深。7d時細(xì)胞腫脹減輕，有少量膠質(zhì)細(xì)胞增生；治療組在組織形態(tài)學(xué)的改變上較組明顯減輕。對照組在12h～7d間變化不明顯。 2．NR1、GluR2的動態(tài)變化對照組：大鼠皮層區(qū)的神經(jīng)元都有弱陽性和部分中等強(qiáng)度表達(dá)，陽性細(xì)胞

8、胞膜反應(yīng)最強(qiáng)，呈棕黃色，斑點狀；胞漿陽性反應(yīng)稍弱，呈黃色，胞核弱陽性反應(yīng)或呈陰性，突起未見明顯著色，陽性細(xì)胞層次清楚，在12h～7d間變化不明顯。 手術(shù)組：腦出血后12h血腫周圍、皮質(zhì)處水腫區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞NR1、GluR2的陽性表達(dá)明顯增加，1d達(dá)到高峰，3d、7d時仍強(qiáng)于正常。 治療組：腦出血后12h～7d間血腫周圍、皮質(zhì)處神經(jīng)細(xì)胞NR1的陽性表達(dá)明顯減少，而GluR2的陽性表達(dá)則明顯增加，1d達(dá)到最高峰，3d、7d時仍

9、強(qiáng)于組。GIuR2、NR1的陽性表達(dá)在1-7d間與組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 3．腦組織含水量的變化手術(shù)組腦組織含水量在出血后12h～1d時增加、3d時水腫達(dá)到峰值、7d明顯減輕，治療組較手術(shù)組則明顯減輕(P<0.05)，對照組在12h～7d間變化不明顯。 結(jié)論 1．拉莫三嗪可以減輕實驗?zāi)X出血大鼠腦組織含水量。 2．拉莫三嗪可以降低血腫周圍、皮質(zhì)處腦組織NRl的表達(dá)，同時升高GluR2的表達(dá)水