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1、背景和目的 腦出血的病理生理學(xué)變化是一相當(dāng)復(fù)雜的過程,涉及血腫的占位性損害、血液成分及其裂解產(chǎn)物的毒性損害,以及興奮性氨基酸(EAA)的毒性作用等不同作用機(jī)制而引起的損傷級聯(lián)反應(yīng),該反應(yīng)大都從興奮毒性開始,興奮毒性是下游事件的觸發(fā)者,是腦細(xì)胞缺血后損傷最關(guān)鍵,最重要的環(huán)節(jié),其中,興奮性氨基酸受體NMDA(N-甲基-D-門冬氨酸)的亞基NR1的激活是興奮毒性的核心,因NR1可以直接或間接啟動電壓依賴性通道,引起Ca<'2+>大量內(nèi)
2、流,造成遲發(fā)性的神經(jīng)元變性壞。而興奮性氨基酸受體AMPA(a-氨基3-羥基5-甲基4-異惡唑丙酸)的亞基GluR2主要是抑制Ca<'2+>內(nèi)流發(fā)揮腦保護(hù)作用。 拉莫三嗪(LTG)主要用于難治性癲癇的治療,近年來發(fā)現(xiàn)其有拮抗EAA興奮性毒性作用,具體機(jī)制仍不太清楚。目前國內(nèi)外有關(guān)腦出血后NRl、GluR2的對比變化,以及與LTG相結(jié)合對神經(jīng)元的保護(hù)與損傷機(jī)制的文獻(xiàn)尚無報道。本實驗通過建立大鼠腦出血模型,采用免疫組織化學(xué)法、干濕重法
3、分別檢測血腫周圍、皮質(zhì)處不同時間點NRl、GluR2的表達(dá)及腦組織含水量的動態(tài)變化,以及LXG對NR1、GluR2、腦水腫三者的干預(yù)情況。以探討NR1、GluR2、LTG對神經(jīng)元的保護(hù)與損傷機(jī)制,為研究EAA的興奮性毒性提供實驗依據(jù)、治療及思路。 材料與方法 1.實驗動物和分組健康成年雄性Wistar大鼠72只,體重220~250g,由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供,合格證號:SYK2006-11。隨機(jī)分為組8只,手術(shù)組32只
4、,治療組32只。后兩組又分為12h、1d、3d、7d四個時間點進(jìn)行HE染色、免疫組織化學(xué)染色和腦組織含水量檢測,每組每個時間點為8只大鼠。 2.腦出血模型的制作和成功的標(biāo)志大鼠經(jīng)10﹪水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后,俯臥位固定于立體定位儀上,用微量進(jìn)樣器由股動脈抽取血液50μL緩慢注入尾狀核位置,留針15min。對照組注入等量生理鹽水。動物麻醉清醒后,參照Zea longa等評分標(biāo)準(zhǔn),累積1分以上為成功模型。 3.
5、組織切片的制備實驗大鼠斷頭取腦后,冠狀面切取針道后約3mm厚的腦片。常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋制成4μ m切片,進(jìn)行蘇木精.伊紅(HE)染色和免疫組化檢測。 4.指標(biāo)檢測 4.1 HE染色:光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理變化。 4.2 NR1、GluR2進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,采用SP法,嚴(yán)格按試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。陽性細(xì)胞的胞膜或胞漿被染成棕黃色。 5.圖像分析 每只大鼠連續(xù)切片,每5張抽取一
6、張切片,對其選取5個不同區(qū)域進(jìn)行高倍鏡(400×)觀察,應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對陽性區(qū)面積平均積分光密度進(jìn)行定量分析。 6.腦組織含水量的測定實驗大鼠斷頭取腦后,取進(jìn)針道前約3mm厚的腦組織。用電子天平先稱取濕重,電熱恒溫培養(yǎng)干燥兩用箱100℃烘烤48h,再稱取干重。利用腦組織含水量=(濕重.干重)/濕重×100﹪進(jìn)行計算。 7.統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)以x±s表示,計數(shù)資料組間比較用方差分析重復(fù)測量法,數(shù)據(jù)處理采用SPSS12.0
7、軟件進(jìn)行分析。以a=0.05作為顯著性檢驗水準(zhǔn)。 1.腦組織形態(tài)學(xué)的改變手術(shù)組組織切片HE染色,腦出血后12h、1d時可見血腫周圍、皮質(zhì)處神經(jīng)細(xì)胞稀疏,胞體腫脹,3d時表現(xiàn)最明顯,細(xì)胞變形壞死,胞漿紅染明顯加深。7d時細(xì)胞腫脹減輕,有少量膠質(zhì)細(xì)胞增生;治療組在組織形態(tài)學(xué)的改變上較組明顯減輕。對照組在12h~7d間變化不明顯。 2.NR1、GluR2的動態(tài)變化對照組:大鼠皮層區(qū)的神經(jīng)元都有弱陽性和部分中等強(qiáng)度表達(dá),陽性細(xì)胞
8、胞膜反應(yīng)最強(qiáng),呈棕黃色,斑點狀;胞漿陽性反應(yīng)稍弱,呈黃色,胞核弱陽性反應(yīng)或呈陰性,突起未見明顯著色,陽性細(xì)胞層次清楚,在12h~7d間變化不明顯。 手術(shù)組:腦出血后12h血腫周圍、皮質(zhì)處水腫區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞NR1、GluR2的陽性表達(dá)明顯增加,1d達(dá)到高峰,3d、7d時仍強(qiáng)于正常。 治療組:腦出血后12h~7d間血腫周圍、皮質(zhì)處神經(jīng)細(xì)胞NR1的陽性表達(dá)明顯減少,而GluR2的陽性表達(dá)則明顯增加,1d達(dá)到最高峰,3d、7d時仍
9、強(qiáng)于組。GIuR2、NR1的陽性表達(dá)在1-7d間與組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 3.腦組織含水量的變化手術(shù)組腦組織含水量在出血后12h~1d時增加、3d時水腫達(dá)到峰值、7d明顯減輕,治療組較手術(shù)組則明顯減輕(P<0.05),對照組在12h~7d間變化不明顯。 結(jié)論 1.拉莫三嗪可以減輕實驗?zāi)X出血大鼠腦組織含水量。 2.拉莫三嗪可以降低血腫周圍、皮質(zhì)處腦組織NRl的表達(dá),同時升高GluR2的表達(dá)水
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