RhoA與2型糖尿病大鼠主動脈病變的關系及辛伐他汀干預的實驗研究.pdf

1、目的：糖尿病大血管病變是對2型糖尿病(type 2diabetes mellitus，T2DM)患者危害最大的慢性并發(fā)癥，它可以導致冠心病、腦血管疾病、四肢壞疽，致殘致死率高。由多種細胞因子和炎性介質參與的非特異性炎癥—動脈粥樣硬化是其病理基礎。小G蛋白RhoA是一類重要的細胞信號轉導的中介分子，其主要作用是水解鳥氨酸。激活后的RhoA通過激活其下游靶分子—Rho激酶(ROCK)調節(jié)細胞的多種行為與功能，包括細胞骨架的組裝、轉錄因子的激

2、活、細胞周期的調節(jié)、平滑肌細胞的收縮遷移、細胞因子的分泌等。Rho蛋白都是在羧基末端被異戊烯化，通過這種異戊烯化作用引起活化的GTP結合形式的Rho蛋白移位到胞膜，繼而和它的效應蛋白作用產生下游反應。Rho蛋白的異戊烯化可被他汀類藥物抑制。以往對他汀類藥物的調脂作用研究較多，但近年來已認識到他汀類藥物具有獨立于調脂作用之外的抗動脈粥樣硬化的作用。本研究通過觀察RhoA在大鼠主動脈中的表達，探討RhoA在糖尿病大血管病變中的作用，并給予糖

3、尿病大鼠辛伐他汀干預治療，探討其對糖尿病大血管病變的防治作用及作用機制。 方法：從50只SD大鼠中隨機抽取10只作為正常對照組(A組)，其余作為實驗組。對照組喂以普通飼料，實驗組喂以高糖高脂飼料。4周后再給予實驗組大鼠STZ 30mg/kg腹腔注射。于實驗第6周末選取空腹血糖(FBG)>7.8 mmol/L且伴有胰島素敏感性降低者作為T2DM動物模型，并隨機分為2組，即T2DM模型組(B組)、T2DM辛伐他汀治療組(C組)。實驗

4、共持續(xù)14周。于第6周末心臟取血測定FBG、空腹胰島素(FINS)水平，計算胰島素敏感指數(ISI)。于第14周末心臟取血測定FBG與血脂。取大鼠主動脈，進行光鏡(HE染色、Masson染色)、電鏡觀察，計算主動脈橫截面病灶總面積與管壁總面積的比值：離體血管實驗檢測血管彈性；應用免疫組化方法檢測RhoA在主動脈組織中的蛋白表達水平。使用計算機圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，計算RhoA的積分光密度(IOD)值。使用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理

5、實驗數據，兩組比較采用t/t’檢驗，組間比較采用方差分析，相關分析采用直線相關。結果1 實驗第6周末各項檢測指標：注射STZ兩周后，實驗組大鼠FBG(12.99±1.16)mmol/L高于正常對照組(5.03±0.69)mmol/L(P<0.01)：FINS 18.79(18.23，19.29)mIU/L與正常對照組18.35(17.95，18.98)mIU/L比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；ISI 0.0048(0.0045，0.0

6、053)低于正常對照組0.0106(0.0103，0.0112)(P<0.01)，至此T2DM模型復制成功。 2.實驗第14周末生化指標：A組大鼠FBG(4.96±0.92)mmol/L，B組大鼠FBG(13.15±1.18)mmol/L及TG、TC、LDL-C、VLDL-C水平均高于A組，HDL-C水平低于A組(均P<0.05)；C組大鼠TG、TC、LDL-C、VLDL-C水平均低于B組，HDL-C水平高于B組(均P<0.05

7、)，FBG(12.70±3.54)mmol/L與B組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 3 組織形態(tài)：HE染色顯示，A組大鼠動脈內膜、中膜、外膜分界清楚，內膜光滑平坦，管腔面內皮細胞扁平完整，緊貼于平直的內彈性膜上，中膜彈性膜與平滑肌細胞平行整齊排列；B組糖尿病大鼠主動脈有不同程度的內膜增厚病灶，局部主要由排列紊亂的平滑肌組成，病灶表面內皮細胞腫脹，有的向腔面突起，有的脫落、甚至壞死，內彈力板局部厚薄不均或分層，中膜淺層平滑肌細胞增生，

8、中層彈力板與平滑肌細胞間排列紊亂，可見隆起于內膜表面的增生性動脈粥樣硬化斑塊，表面為纖維組織，內膜下可見增生的平滑肌細胞斷裂、巨噬細胞、泡沫細胞及細胞外脂質、基質；C組(辛伐他汀干預組)，大鼠主動脈內膜增厚較平坦，內皮細胞扁平，內彈力板較平直，中彈力板與平滑肌細胞之間較整齊相間排列，且有不同程度的血管平滑肌細胞增生，接近于正常大鼠動脈，可見少量的泡沫細胞，但無明顯斑塊形成。各組主動脈橫截面病灶總面積與管壁總面積比值分別為：A組0.49±

9、0.10％；B組0.91±0.06％；C組0.81±0.13％。B組較A組病變程度明顯加重，C組較B組病變程度明顯減輕，(均P<0.01)。相關分析表明主動脈病變程度與RhoA表達水平呈正相關(r=0.837，P<0.01)。 Masson染色彈性、膠原纖維呈藍色，胞質呈紅色，細胞核呈藍褐色，A組大鼠血管彈力膜較薄，彈性纖維分布均勻；B組大鼠彈力膜增厚，彈性纖維卷曲、排列紊亂，可見斷裂，細胞外膠原纖維明顯增多；C組大鼠血管彈力膜

10、稍微增厚，可見較多的彈性纖維和膠原纖維。 透射電鏡下可見B組大鼠血管內皮細胞的部分細胞膜脫落，細胞質水腫，線粒體融合，大量線粒體有空泡現象，粗面內質網擴張、脫顆?，F象明顯，游離核糖體數量明顯減少。C組大鼠血管內皮細胞水腫，血管內皮下層增厚明顯，厚薄不均，細胞膜缺失、破損。 4 離體血管實驗：取大鼠胸主動脈離體灌流并通過生物信號采集系統(tǒng)記錄張力變化，檢測其對KCI、苯腎上腺素(PE)誘導的收縮反應，對乙酰膽堿(Ach)誘導的舒張反

11、應。與A組比較，B、C組主動脈環(huán)對KC1、PE誘導的收縮反應明顯增強(P<0.01)；對Ach誘導的舒張反應明顯減弱(P<0.01)。與B組相比，C組主動脈環(huán)對KC1和PE的收縮反應明顯減弱(P<0.01)，對Ach誘導的舒張反應明顯增強(P<0.01)。 5 免疫組化染色：圖像分析顯示，B組大鼠RhoA蛋白表達的IOD值(788.21±13.29)是A組(272.95±18.44)的2.89倍，C組(592.83±71.87)

12、比B組降低了25％(均P<0.05)。相關分析表明大鼠主動脈RhoA.表達水平與FBG、LDL-C、VLDL、主動脈病變程度，及離體主動脈環(huán)對60mmol/L KC1的最大收縮反應呈正相關(分別r=0.837、0.648、0.568、0.837和0.913，均P<0.01)，與HDL-C呈負相關(r=-0.781，P<0.01)。 結論 1.動脈粥樣硬化是T2DM大血管病變的主要病理基礎。 2.T2DM主動脈的收