人類皰疹病毒6型7型潛伏與復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍發(fā)生的相關(guān)性研究.pdf

1、背景與目的： 復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍(recurrent aphthous ulcer，RAU)是最常見的口腔黏膜疾病，患病率高達(dá)20％左右，具有反復(fù)發(fā)作和緩慢自愈的特點(diǎn)，但病因不明。以往的學(xué)者用各種檢測病毒的方法包括經(jīng)典的電鏡下觀察病毒顆粒、病毒培養(yǎng)、免疫血清學(xué)研究和現(xiàn)代的分子生物學(xué)技術(shù)如PCR等，分別以RAU患者病損組織、脫落上皮、唾液、外周血其中的一種或幾種作為研究對象，檢測病毒顆粒、DNA片段或血清特異性抗體，他們研究過的病毒

2、包括腺病毒、人類乳頭瘤病毒及人類皰疹病毒1至8型[1-10]，但是大多數(shù)沒有陽性結(jié)果，或患病組與對照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，或有的病毒在人體分布極其廣泛因而在病變部位的檢出也不具臨床意義，亦或在實(shí)驗(yàn)方法上不統(tǒng)一、不完善，各結(jié)果之間不具可比性甚至互相矛盾。最近實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR；FQ-PCR)技術(shù)[11]在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多，具有許多常規(guī)PCR不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。

3、它在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上又增加了TaqMan探針和熒光信號，增加了目的片段擴(kuò)增的特異性和敏感性。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，同時(shí)檢測臨床唾液、脫落上皮細(xì)胞(病損區(qū)和非病損區(qū))、外周血(白細(xì)胞和血漿)樣本中人類皰疹病毒6和7型的DNA，進(jìn)而探索人類皰疹病毒6型7型潛伏與復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍發(fā)生的相關(guān)性。 方法：

4、 2007年4月至2007年9月，在大連醫(yī)科大學(xué)附屬一院的口腔科以及大醫(yī)整形美容口腔門診，經(jīng)臨床診斷確定的輕型RAU患者20例，進(jìn)行臨床采樣，樣本包括唾液，健康黏膜處脫落上皮細(xì)胞，病變處脫落細(xì)胞，外周血(白細(xì)胞和血漿)。同時(shí)期選擇接近處理組年齡、性別及社會生活背景分布特征的健康對照組20例健康對照，取口腔黏膜脫落上皮細(xì)胞、唾液和外周血(白細(xì)胞和血漿)，大連醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室核酸組進(jìn)行樣本保存和DNA提取。同期于美國ABI生物公

5、司購買HHV-6及HHV-7(08-765-000)標(biāo)準(zhǔn)毒株：根據(jù)病毒基因文庫調(diào)出的HHV-6、7基因序列，設(shè)計(jì)并合成引物、熒光標(biāo)記探針。先用特異性引物篩選HHV-6、7，其PCR片段克隆入載體，再對重組質(zhì)粒進(jìn)行篩選、測序及鑒定。確證后的DNA片段制成標(biāo)準(zhǔn)品并作為陽性模板，開發(fā)FQ-PCR檢測系統(tǒng)。用該系統(tǒng)測定研究樣品。最后180例提取出的總DNA本送寶生物公司進(jìn)行病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。 結(jié)果： 1．本次實(shí)驗(yàn)180

6、個(gè)標(biāo)本只有一名患者病損處脫落細(xì)胞有HHV-7檢出，其余病毒均檢出于唾液標(biāo)本，兩組中病毒的檢出率分別為，20例輕型RAU患者組HHV-6檢出為20％(4/20)，HHV-7檢出為35％(7/20)；20個(gè)對照組HHV-6檢出10％(2/20)，HHV-7檢出15％(3/20)。 2．卡方檢驗(yàn)對HHV-6、HHV-7陽性例數(shù)分別進(jìn)行了對照組和病例組的組間比較，結(jié)果P>0.05，無顯著性差異。對病例組兩種病毒感染率做病毒組間比較，結(jié)果

7、尚不能認(rèn)為兩種病毒對RAU患者感染率不同。 3．采用兩組獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)方法，對病例組4例和對照組2例HHV-6陽性檢出病毒的拷貝數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，結(jié)果P<0.05，說明組間HHV-6病毒拷貝數(shù)有顯著差別，結(jié)果認(rèn)為HHV-6病毒在組織細(xì)胞內(nèi)增殖與RAU潰瘍的發(fā)生可能有相關(guān)性。 結(jié)論： 1.HHV-6、HHV-7隨機(jī)廣泛潛伏于人群中，其DNA陽性檢出對于RAU患者或健康個(gè)體不具診斷意義。 2．HHV-6、