非小細胞肺癌轉移相關基因LongSAGE篩查的初步研究.pdf

1、目的：近年來，肺癌的發(fā)病率逐年上升。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌所有病例的80％以上。由于常發(fā)生遠處轉移，肺癌患者的5年生存率只有15％左右。雖然大多數(shù)腫瘤是單克隆起源的，但由于腫瘤的遺傳學不穩(wěn)定性和靶器官的選擇作用，腫瘤常常表現(xiàn)為一個不斷變異的群體，有些瘤細胞亞群得以雜在靶器官優(yōu)勢生長，獲得轉移表型。在這個過程中，有大量基因的表達發(fā)生著改變。與原發(fā)瘤細胞相比，一部分癌細胞可能被

2、賦予一些特殊的生物學性狀而具有非凡的轉移能力。尋找這些差異表達的基因，對于闡明腫瘤轉移的發(fā)生機制，乃至設計相應的阻斷靶點，最終抑制轉移，具有十分重要的理論意義及臨床應用前景。本實驗利用穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白(GFP)的人巨細胞肺癌細胞株95D，建立肺癌裸鼠皮下移植及肺轉移模型，用熒光激活的流式細胞分選術(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)分別純化原發(fā)灶和肺部轉移灶癌細胞，利用近年來迅速發(fā)展的

3、一種快速分析基因表達信息的技術---基因表達系列分析(Serial Analysis of Gene Expression.SAGE)，從全基因組水平對裸鼠肺癌轉移模型皮下原發(fā)灶和肺部轉移灶的癌細胞的基因表達譜進行比較和分析，為尋找在肺癌轉移過程中發(fā)生改變的基因做出嘗試，為進一步研究肺癌轉移機制打下基礎。 方法: 1.利用逆轉錄病毒將GFP導入人高轉移肺癌細胞株95D，經(jīng)過G418篩選和克隆化培養(yǎng)，用熒光顯微鏡及流式細胞

4、儀檢測GFP基因在癌細胞體外的表達，繪制細胞生長曲線，檢測細胞貼壁率等，觀察穩(wěn)定表達GFP的癌細胞的細胞生物學行為有無改變。 2.95D/GFP-1細胞接種裸鼠背部皮下，成瘤2月后，常規(guī)麻醉裸鼠，熒光體視鏡結合解剖觀察皮下原發(fā)灶腫瘤及遠處臟器，尋找轉移病灶，并利用FACS法純化病灶腫瘤細胞。 3.利用SAGE技術，建立皮下原發(fā)病灶和肺部轉移病灶腫瘤細胞表達序列標簽(expression sequence tags，EST

5、)文庫，對照美國國立生物技術信息中心(National Centerof Biotechnolgy Information，NCBI)的SAGEMAP數(shù)據(jù)庫，獲得對應基因，比較兩個文庫尋找差異基因。 結果: 1.攜帶GFP的逆轉錄病毒有效感染95D細胞，篩選出一株能穩(wěn)定、高效、持久地表達GFP且生物學特性無明顯改變的細胞株95D/GFP-1。 2.95D/GFP-1接種至裸鼠皮下后，2周左右成瘤，2月后可發(fā)生淋巴

6、結、肺部、肝臟的自發(fā)性轉移。皮下腫瘤原發(fā)病灶在熒光體視鏡下可清晰觀察到腫瘤侵犯范圍及周邊血管生長情況，裸鼠大體解剖后可觀察到轉移淋巴結和肺臟轉移灶腫瘤細胞的GFP表達。 3.FACS法純化皮下原發(fā)灶及肺部轉移灶腫瘤細胞，利用SAGE技術，皮下原發(fā)灶共獲得長標簽5420個，肺部轉移灶共獲得長標簽5016個。通過比較兩個文庫中標簽序列特性及對應基因，以差異在4倍以上為標準，在轉移灶中獲得了20個下調基因和33個上調基因。 結

7、論: 1.穩(wěn)定表達GFP的人高轉移肺癌細胞株95D/GFP-1的建立為實時觀察和示蹤肺癌侵襲和轉移的發(fā)生提供了理想的細胞株。 2.95D/GFP-1皮下接種BALB/C裸鼠可在肝臟、肺部和淋巴結形成轉移灶，成功構建了人肺癌細胞株自發(fā)轉移模型。 3.成功建立了人肺癌細胞株皮下原發(fā)灶和肺部轉移灶兩個SAGE文庫，通過比較獲得了差異表達基因共53個，腫瘤獲得轉移潛能可能與這些基因表達改變有關。并擬繼續(xù)深入研究這些基因在