應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)篩選小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的初步研究.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)篩選小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的初步研究姓名：張磊申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：田大力20040401實(shí)驗(yàn)材料1實(shí)驗(yàn)材料：標(biāo)本來源于中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院胸外科手術(shù)切除的五例小細(xì)胞肺癌標(biāo)本，術(shù)中切取肺原發(fā)癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織。術(shù)后經(jīng)病理驗(yàn)證確實(shí)為小細(xì)胞肺癌。2實(shí)驗(yàn)試劑：本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用錨定引物丌(dTl2)APs和隨機(jī)引物M13r—ARPs。RNA提取(TRLZOL)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為GIBC

2、OBRL公司產(chǎn)品；PCR試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品；Genomyx熒光差異試劑盒及主要儀器設(shè)備GenomyxDNA電泳及熒光掃描系統(tǒng)為美國BECKMAN公司產(chǎn)品。3主要儀器設(shè)備：LM200激光顯微細(xì)胞俘獲系統(tǒng)，自動電泳凝膠成像分析儀，臺式低溫高速冷凍離心機(jī)，PCR擴(kuò)增儀，GenomyxLRDNA電泳系統(tǒng)及GenomyxSC熒光掃描分析系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)方法1應(yīng)用PixcellIILCM激光顯微細(xì)胞俘獲系統(tǒng)分別提取小細(xì)胞肺癌原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌

3、的單純癌細(xì)胞各約8000個。2，Trizo]法分別提取小細(xì)胞肺癌原發(fā)癌與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的RNA。將LCM捕獲細(xì)胞的帽蓋于預(yù)先加有200mTrizol試劑的05mlEppendoff管上，倒置離心管，室溫靜置30min，加40m氯仿劇烈振蕩15秒后室溫靜置15min，離心40C11000轉(zhuǎn)15rain，將上清液移至另一新管加100一異丙醇混勻，一70％放置30min后離心4。C11000轉(zhuǎn)10rain，棄上清，加入75％DEPC乙醇200止

4、漂洗，離心4℃11000轉(zhuǎn)5min，棄上清空氣干燥15rain，沉淀溶于經(jīng)DEPC處理的去RNA酶水中，55。C水浴中孵育10rain，所得樣品置一70。C保存。3eDNA第一鏈的合成(RT—PCR)：PCR熱循環(huán)儀中應(yīng)用錨定引物一T7(dTl2)AP9，T7(dTl2)APl2，分別合成原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的eDNA第一鏈。4PCR(DD—PCR)：以逆轉(zhuǎn)錄合成的eDNA第一鏈為模板，用錨定引物一TMR—T7(dTl2)AP9，TMR