肝癌胚胎抗原的篩選及鑒定.pdf

1、目的肝細(xì)胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)為廣西高發(fā)腫瘤，是死亡率最高的惡性腫瘤之一。通過SEREX技術(shù)，用人肝癌血清從人體胚胎干細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選肝癌相關(guān)抗原，并對(duì)SEREX條件方法作進(jìn)一步的改良；對(duì)篩選出的抗原進(jìn)行分子鑒定并對(duì)其中的抗原進(jìn)行細(xì)胞和組織學(xué)分析。 方法:頂層培養(yǎng)基Top-agar作梯度濃度和梯度體積實(shí)驗(yàn)，確定在最佳濃度和體積情況下Top-agar粘附在NC膜上最少；用膜吸收和親

2、和偶聯(lián)層析兩種方法分別對(duì)血清進(jìn)行預(yù)處理，確定能最多消除假陽(yáng)性的血清預(yù)處理方法。預(yù)處理38例原發(fā)性肝癌病人血清，結(jié)合SEREX技術(shù)，應(yīng)用Westernblot方法，對(duì)表達(dá)文庫(kù)中的相關(guān)抗原做血清學(xué)免疫篩選。對(duì)第一輪篩選的肝癌相關(guān)抗原再進(jìn)行復(fù)篩。陽(yáng)性克隆體內(nèi)刪除，雙酶切鑒定后，進(jìn)行測(cè)序及生物信息學(xué)分析。對(duì)篩選出的肝癌抗原之一Cap2做肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌細(xì)胞株及正常肝細(xì)胞株RT-PCR鑒定，同時(shí)使用組織芯片做原位RT-PCR鑒定其組織表達(dá)

3、譜。 結(jié)果:經(jīng)探索，在直徑為150mm培養(yǎng)皿中最適揭膜條件為0.83％濃度的Top-agar15ml培養(yǎng)噬菌體后在4℃放置20分鐘揭膜。親和偶聯(lián)預(yù)處理血清的效果好于膜吸收的效果。在SEREX初篩選中，我們得到了176例陽(yáng)性噬菌體克隆，對(duì)單克隆分別進(jìn)行假陽(yáng)性排除，最終得31例噬菌體陽(yáng)性克隆。體內(nèi)刪除法獲得相應(yīng)的質(zhì)粒。質(zhì)粒T3、T7引物測(cè)序發(fā)現(xiàn)1例無信號(hào)出現(xiàn)。30例抗原中23例為已知蛋白質(zhì)，7例與已知蛋白質(zhì)同源性相差較大，為未知蛋白

4、質(zhì)。針對(duì)其中的肝癌相關(guān)抗原Cap2(144號(hào)calponin2)做進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)，其在肝癌、胃癌、肺癌等細(xì)胞株中有強(qiáng)表達(dá)，在乳腺癌細(xì)胞株中有弱表達(dá)而在正常肝細(xì)胞株中未見表達(dá)。同時(shí)進(jìn)行組織芯片insituRT-PCR鑒定，在167例肝癌組織中89例顯陽(yáng)性，50例正常組織4例出現(xiàn)陽(yáng)性，在肝癌和正常肝組織中表達(dá)有差異(p<0.05)。 結(jié)論:首次在人體胚胎干細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選肝癌抗原。從人胚胎干細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的共性著手，依據(jù)它