芩丹膠囊抑制血管外膜重構(gòu)的實驗研究.pdf

1、第一部分芩丹膠囊對自發(fā)性高血壓大鼠血管外膜膠原合成的影響
　　 研究背景
　　 原發(fā)性高血壓是臨床常見病和多發(fā)病，是引發(fā)心、腦血管和腎病變的一個重要的危險因素。血管重構(gòu)(Vascularremodeling，VR)是高血壓靶器官損害的病理基礎(chǔ)，發(fā)掘和研究能對抗和逆轉(zhuǎn)VR的抗高血壓藥物具有重大意義。
　　 血管外膜是最早發(fā)生病理變化的血管結(jié)構(gòu)，是VR的重要參與者，近年來發(fā)現(xiàn)其對高血壓的反應(yīng)較血管內(nèi)膜和中膜更為敏感。

2、血管外膜的主要細胞類型是外膜成纖維細胞(Adventitialfibroblast，AF)，在系統(tǒng)調(diào)節(jié)機制作用下，成為參與VR的重要細胞。在損傷作用下，AF可發(fā)生表型改變、增殖和遷移活性提高，釋放細胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)，促進新生外膜形成，導致血管外膜重構(gòu)。血管外膜在高血壓血管重構(gòu)中的作用越來越受到重視，針對干預血管外膜重構(gòu)的藥物研究具有理論依據(jù)和應(yīng)用價值。
　　 膠原是ECM的重要成分，Ⅰ型

3、和Ⅲ膠原蛋白是血管壁的主要膠原蛋白類型。膠原的合成多于降解，膠原蛋白異常表達是高血壓血管病變的重要病理變化。血管壁AF也是合成膠原蛋白的主要細胞類型，轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1）是刺激AF合成和膠原蛋白沉積的強大始動因子，可在明顯促進膠原蛋白基因轉(zhuǎn)錄的同時，抑制新合成膠原蛋白的降解。TGF-β1的經(jīng)典下游信號通路是Smad信號通路。Smad3是受體調(diào)節(jié)型Smad(Receptor

4、activatedSmad，R-Smad)蛋白的重要成員，在TGF-β1細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路中發(fā)揮著核心的作用。我們的前期體外研究，發(fā)現(xiàn)Smad3在TGF-β1誘導的AF轉(zhuǎn)化和膠原沉積中起重要作用。
　　 芩丹膠囊（QindanCapsule，QC）是導師的臨床經(jīng)驗方，用于原發(fā)性高血壓病肝熱血瘀證的治療。多年來，針對QC的療效和藥理作用機制進行了系列研究。以往的臨床實驗研究，發(fā)現(xiàn)QC能夠在有效降壓的同時，降低原發(fā)性高血壓患者血漿中

5、的TGF-β1水平，改善其肝熱血瘀證的臨床癥狀和血栓前狀態(tài);在體動物實驗研究，發(fā)現(xiàn)QC能夠有效降低自發(fā)性高血壓大鼠(SpontaneousHypertensiveRat，SHR)的血壓和血漿中的血管緊張素Ⅱ(AngiotoninⅡ，AngⅡ)水平，抑制骨橋蛋白(Osteopondin，OPN)表達和血管平滑肌細胞(VascularSmoothMuscleCell，VSMC)轉(zhuǎn)化，下調(diào)動脈中膜的膠原容積比例，提高動脈形態(tài)學指標，起到逆轉(zhuǎn)S

6、HR動脈中膜重構(gòu)的作用;近期的體外細胞研究，發(fā)現(xiàn)QC在降低TGF-β1刺激引起AF的膠原蛋白高表達的同時，抑制了Smad3的活性。本研究在已往研究的基礎(chǔ)上，通過對SHR動脈外膜病理變化的觀察，及Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β1、Smad3在外膜表達的檢測，進一步研究和探討QC對高血壓血管外膜重構(gòu)的作用和機制，為其臨床應(yīng)用提供科學依據(jù)。
　　 目的
　　 1.觀察芩丹膠囊對SHR大鼠血壓和胸主動脈外膜形態(tài)學的改變。
　　

7、 2.檢測芩丹膠囊對SHR大鼠胸主動脈外膜中Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β1、Smad3表達的改變。
　　 方法
　　 1.研究對象:
　　 (1)實驗動物:24只（重250-290g）的14周齡雄性SHR大鼠和8只(重240-280g)的14周齡京都(Wistar-Kyoto，WKY)大鼠。
　　 (2)實驗分組:24只SHR大鼠隨機平均分為3組:陽性對照組、QC治療組、氯沙坦治療組;8只WKY大鼠設(shè)為陰性對

8、照組。
　　 (3)實驗給藥:QC治療組給予芩丹膠囊750mg/kg/d，氯沙坦治療組給予氯沙坦30mg/kg/d，陽性對照組和陰性對照組分別給予等量生理鹽水。所有大鼠均每日1次同時灌胃，連續(xù)12周。
　　 (4)實驗取材:大鼠末次灌胃后禁食24h，10％水合氯醛腹腔注射，麻醉后取胸主動脈血管。
　　 2.研究內(nèi)容:
　　 (1)tail-cuffplethysmographic(TCP)測壓法測定大鼠收

9、縮壓。
　　 (2)VanGieson(V-G)染色法觀察大鼠胸主動脈外膜的組織形態(tài)。
　　 (3)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(ReversetranscriptionPCR，RT-PCR)法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β1、Smad3的mRNA表達。
　　 (4)免疫組化法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β1、Smad3的蛋白表達。
　　 3.統(tǒng)計學處理:
　　 實驗數(shù)據(jù)均用(x)±s表示，應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPS

10、S20.0進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。t檢驗用于兩組間的比較，雙因素方差分析用于多組間的比較。
　　 結(jié)果
　　 1.各實驗組大鼠血壓的比較
　　 在用藥前，與陰性對照組中血壓正常的WKY大鼠（14周齡）比較，陽性對照組、QC治療組、氯沙坦治療組中所有SHR大鼠（14周齡）血壓已經(jīng)明顯升高(P＜0.01)，陽性對照組和QC治療組、氯沙坦治療組相比差異無顯著性(P均＞0.05)。在用藥過程中，陽性對照

11、組SHR大鼠血壓呈升高趨勢，QC治療組、氯沙坦治療組中所有SHR大鼠血壓持續(xù)下降，陰性對照組中WKY大鼠血壓穩(wěn)定在正常范圍。用藥結(jié)束，與陰性對照組中血壓正常的WKY大鼠（26周齡）相比，陽性對照組SHR大鼠（26周齡）血壓顯著降低(P＜0.01)。從給藥第3周起，QC治療組、氯沙坦治療組大鼠和陽性對照組大鼠相比，血壓均有下降(P＜0.05或P＜0.01)。給藥5周后至給藥結(jié)束，QC治療組、氯沙坦治療組大鼠和陽性對照組大鼠相比，血壓有明顯

12、下降（P均＜0.01）。給藥期間，QC治療組、氯沙坦治療組大鼠血壓下降的比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 2.各實驗組大鼠用藥后胸主動脈外膜組織形態(tài)比較
　　 V-G染色顯示，陰性對照組WKY大鼠血管壁外膜排列整齊，膠原組織分布均勻，著色淺淡;陽性對照組SHR大鼠管壁外膜明顯增厚，僵硬變直甚至斷裂剝脫，膠原面積明顯增加，著色深染;與陽性對照組相比，QC治療組、氯沙坦治療組血管壁外膜明顯變薄，排列較規(guī)整，膠原

13、面積明顯減少，著色變淺。QC治療組和氯沙坦治療組間的比較無明顯差別。
　　 3.各實驗組大鼠用藥后胸主動脈外膜Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β1、Smad3的mRNA表達比較
　　 與陰性對照組26周齡血壓正常的WKY大鼠相比，陽性對照組26周齡的SHR大鼠胸主動脈外膜組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β1、Smad3的mRNA表達顯著升高(P＜0.01);而同周齡QC治療組、氯沙坦治療組SHR大鼠外膜組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β1

14、、Smad3的mRNA表達，較陽性對照組SHR大鼠均下降(P＜0.05或P＜0.01);QC治療組和氯沙坦治療組間的比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 4.各實驗組大鼠用藥后胸主動脈外膜Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β1、Smad3的蛋白表達比較
　　 與陰性對照組26周齡血壓正常的WKY大鼠相比，陽性對照組26周齡的SHR大鼠胸主動脈外膜組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β1、Smad3的蛋白表達顯著升高(P＜0.01)

15、;而QC治療組、氯沙坦治療組中同周齡SHR大鼠外膜組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGF-β1、Smad3的蛋白表達，較陽性對照組SHR大鼠均下降(P＜0.05或P＜0.01);QC治療組和氯沙坦治療組間的比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 結(jié)論
　　 1.芩丹膠囊對SHR大鼠有明顯的的降壓作用，降壓機制與降低SHR大鼠血管外膜TGF-β1和Smad3的表達有關(guān)。
　　 2.芩丹膠囊能夠降低SHR大鼠血管外膜中膠

16、原的表達，改善外膜形態(tài)學，對血管外膜重構(gòu)有抑制或逆轉(zhuǎn)作用，機制與抑制TGF-β1/Smad3信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)。
　　 第二部分芩丹膠囊含藥血清對血管外膜成纖維細胞TGF-β1/ERK信號轉(zhuǎn)導通路的影響
　　 研究背景
　　 血管重構(gòu)(Vascularremodeling，VR)是心血管疾病發(fā)病的病理基礎(chǔ)，也是高血壓靶器官損害的病理基礎(chǔ)，發(fā)掘和研究能對抗和逆轉(zhuǎn)VR的抗高血壓藥物具有重大意義。
　　 血管外膜

17、對血壓的改變最為敏感，成纖維細胞是血管外膜中的主要細胞成分，其生物學活性異?？蓪е卵軗p傷后不良重構(gòu)和血管再狹窄的發(fā)生。高血壓可促使血管外膜成纖維細胞(Adventitialfibroblast，AF)變?yōu)榧〕衫w維細胞(Myofibroblast，MF)，MF遷移至中膜或內(nèi)膜，同時可促進細胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)合成，發(fā)生纖維化，縮窄血管管腔，導致VR發(fā)生。
　　 轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transf

18、orminggrowthfactorβ1，TGF-β1）與VR的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系最為密切，是刺激AF發(fā)生表型轉(zhuǎn)換、增殖和遷移、合成ECM最重要和最直接的信號因子。Smad信號通路也是近年發(fā)現(xiàn)的，與眾多組織纖維化密切相關(guān)的TGF-β1下游信號通路。我們以前的研究已證實Smad2和Smad3介導了AF對TGF-β1的反應(yīng)。而TGF-β1的生物學功能也受絲裂素活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)

19、的調(diào)控，該作用能被特異性MAPK抑制劑阻斷。MAPK信號途徑(主要包括ERK、JNK及p38)是細胞內(nèi)最重要的網(wǎng)絡(luò)信號之一，參與介導細胞增殖、遷移、分化等多種病理生理過程，與纖維化性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。由受體酪氨酸激酶激活的MAPK通過磷酸化Smads作用可以改變TGF-β1信號。研究具體信號通路TGF-β1/ERK在高血壓血管重構(gòu)中的作用和機制具有重要意義。
　　 血管重構(gòu)的過程是一個伴隨著ECM大量合成與降解的過程?；|(zhì)金屬

20、蛋白酶(Matrixmetalloproteinase，MMP)是機體內(nèi)降解ECM的主要酶系，MMP2和MMP9是其主要成分，基質(zhì)金屬蛋白酶合成(Matrixmetalloproteinasesynthesis,MMPs)在高血壓的血管重構(gòu)過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 結(jié)締組織生長因子(Connectivetissuegrowthfactor，CTGF)是一種可刺激成纖維細胞增殖和分泌膠原蛋白的生長因子，能夠促進細胞有絲分裂、參

21、與凋亡調(diào)節(jié)及血管形成，與動脈粥樣硬化和器官纖維化疾病的發(fā)生密切相關(guān)。CTGF基因?qū)偌纯淘缙诨?，啟動子中含有TGF-β1的應(yīng)答元件，能夠被TGF-β1選擇性地誘導后激活，并且作為其下游介質(zhì)，促進ECM的合成。目前，CTGF與血管功能和不良重構(gòu)的研究成為研究心血管病防治的重要靶點。
　　 高血壓病屬于中醫(yī)學“眩暈”范疇，肝熱血瘀證是臨床常見證型。芩丹膠囊(Qindancapsule，QC)是導師應(yīng)用多年治療肝熱血瘀型高血壓病的臨床

22、經(jīng)驗方，以往的研究表明，QC通過影響TGF-β1/Smad信號通路，抑制AF增殖和膠原合成，在逆轉(zhuǎn)老年自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneoushypertensiverat，SHR)血管外膜重構(gòu)中發(fā)揮重要作用，但是其對AF的生物活性、MMP2和MMP9、CTGF的合成及TGF-β1/ERK信號通路的影響尚不明了。本研究在已往研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)探討QC對TGF-β1誘導的AF增殖和遷移活性、周期和凋亡調(diào)控及MMPs和CTGF合成的影響，以

23、及在此過程中TGF-β1/ERK信號轉(zhuǎn)導通路的作用，以期為該臨床驗方的應(yīng)用和開發(fā)提供更多科學依據(jù)。
　　 目的
　　 1.觀察QC含藥血清對TGF-β1誘導的AF增殖、遷移、周期和凋亡調(diào)控的變化，證實QC對TGF-β1誘導的AF生物活性的影響。
　　 2.觀察QC含藥血清對TGF-β1誘導的AF中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(Extracellularsignal-regulatedkinase1/2，ERK1/2)

24、、磷酸化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(phospho-ERK1/2，p-ERK1/2)、MMP2、MMP9和CTGF表達的變化，證實QC對AF中基質(zhì)金屬蛋白酶和結(jié)締組織生長因子合成的影響，探討TGF-β1/ERK信號轉(zhuǎn)導通路在血管外膜重構(gòu)中的作用。
　　 方法
　　 1.制備芩丹膠囊含藥血清:90只（重240-280g）14周齡雄性京都（Wistar-Kyoto，WKY）大鼠隨機分成3組:芩丹膠囊大劑量組(QCH組)給予芩

25、丹膠囊750mg/kg/d，芩丹膠囊小劑量組(QCL組)給予芩丹膠囊150mg/kg/d，氯沙坦組(Losartan組)給予氯沙坦30mg/kg/d。各實驗組大鼠均予以灌胃給藥，每日2次，連續(xù)4天。大鼠末次給藥后禁食24h，麻醉1.5h后，經(jīng)腹主動脈取血，分離血清，同一組混勻，濾菌，56℃滅活30min，在低溫真空干燥機中制成血清冰凍干粉，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.外膜成纖維細胞獲取和干預:(1)剝脫WKY大鼠胸主動脈血管外

26、膜，組織貼塊法原代培養(yǎng)纖維母細胞，凍存、復蘇、傳代培養(yǎng)成纖維細胞。(2)含藥血清預刺激:傳代培養(yǎng)的外膜成纖維細胞換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4h后，在無血清培養(yǎng)基中加入等容的血清凍干粉培養(yǎng)48h。陰性對照組不加任何處理因素。(3)TGF-β1誘導:用含有TGF-β1(20ng/ml)的普通培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。
　　 3.實驗分組:分為5組:(1)陰性對照(negativecontrol，NC)組(2)陽性對照(positivecontrol

27、，PC)組(3)芩丹膠囊大劑量(QCH)組(4)芩丹膠囊小劑量(QCL)組(5)氯沙坦(Losartan)組
　　 4.研究內(nèi)容:(1)MTT比色法(MTTcolorimetryassay)檢測細胞增殖率。(2)劃痕技術(shù)(Transwellassay)測定細胞遷移能力。(3)流式細胞學檢測和分析細胞周期和凋亡調(diào)控。(4)反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈鎖反應(yīng)(ReverseTranscription-PolymeraseChainReactio

28、n,RT-PCR)檢測CTGF、MMP2和MMP9的mRNA表達。(5)蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)檢測ERK1/2、p-ERK1/2、CTGF、MMP2和MMP9的蛋白表達。
　　 5.統(tǒng)計學處理:
　　 實驗數(shù)據(jù)均用(x)±s表示，應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS20.0進行分析，t檢驗用于兩組間的比較，方差分析用于多組間的比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果
　　 1.各實驗組AF增殖活性

29、比較
　　 與NC組相比，PC組AF增殖活性明顯增強(P＜0.01);經(jīng)藥物處理后，QCH組、QCL組和Losartan組增殖活性均有減弱，與PC組相比，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05或P＜0.01);QCH組和Losartan組間的比較，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 2.各實驗組AF遷移數(shù)量比較
　　 與NC組相比，PC組AF遷移數(shù)量明顯增多(P＜0.01);經(jīng)藥物處理后，QCH組、QCL組和Losarta

30、n組遷移數(shù)量均有減少，與PC組相比，均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);QCH組和Losartan組間的比較，無統(tǒng)計學意義P＞0.05)。
　　 3.各實驗組AF細胞周期比較
　　 與NC組相比，PC組AF的G0/G1和G2/M的細胞百分比明顯增大(P＜0.01和P＜0.05);經(jīng)藥物處理后，QCH組、QCL組和Losartan組AF的G0/G1和G2/M細胞百分比均有減少，與PC組相比，均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);QC

31、H組和Losartan組間的比較，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 4.各實驗組AF細胞凋亡比較
　　 與NC組相比，PC組AF的早期凋亡細胞百分比明顯減少（P＜0.01）;經(jīng)藥物處理后，QCH組、QCL組和Losartan組早期凋亡細胞百分比均有增大，與PC組相比，均有統(tǒng)計學差異(P＜0.01或P＜0.05);QCH組和Losartan組間的比較，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 5.各實驗組AF中CT

32、GF、MMP2和MMP9的mRNA表達比較
　　 與NC組相比，PC組AF的CTGF、MMP2和MMP9的mRNA表達明顯增強(P＜0.01):經(jīng)藥物處理后，QCH組、QCL組和Losartan組CTGF、MMP2和MMP9的mRNA表達明顯減弱，與PC組相比，均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05）;QCH組和Losartan組間的比較，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 6.各實驗組AF中ERK1/2、p-ERK1/2、CT

33、GF、MMP2和MMP9的蛋白表達比較
　　 與NC組相比，PC組的p-ERK1/2、CTGF、MMP2和MMP9的蛋白表達明顯增強（P＜0.01）;經(jīng)藥物處理后，QCH組、QCL組和Losartan組AF的p-ERK1/2、CTGF、MMP2和MMP9的蛋白表達明顯減弱，與PC組相比，均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);QCH組和Losartan組間的比較，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。ERK1/2蛋白的表達在所有實驗組間的比較，