CD40-CD40L系統(tǒng)在腦梗塞疾病發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一章 CD40基因多態(tài)性與漢族人群腦梗塞遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究
　　研究背景:腦梗塞(cerebral infarction，CI)又名缺血性腦卒中，主要是由于腦動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)和血栓形成，使管腔狹窄甚至閉塞，導(dǎo)致急性局灶性腦供血不足而引起的疾病。CI發(fā)病率高、死亡率高，并呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類健康。大量證據(jù)表明AS是CI的主要病理基礎(chǔ)。多種分子和信號(hào)途徑參與了CI的病理生理過程。CD40

2、/CD40L信號(hào)參與調(diào)控免疫、炎癥、氧化應(yīng)激、高凝等多種病理生理狀態(tài)，在AS發(fā)生、發(fā)展以及斑塊破裂諸多環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用。國內(nèi)外大量的研究已經(jīng)證實(shí)，CI是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用所導(dǎo)致的多基因疾病，多種基因的遺傳多態(tài)性與CI的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，編碼合成人類CD40的基因也存在單個(gè)核苷酸序列多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，這些功能性SNP可以通過改變CD40的表達(dá)和活性，引

3、起下游生物學(xué)效應(yīng)的相應(yīng)變化，從而影響包括CI在內(nèi)的一系列自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。
　　目的:通過病例-對(duì)照研究，闡明CD40基因多態(tài)性與漢族人群CI遺傳易感性關(guān)聯(lián)關(guān)系，為CI形成的機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，并為尋找CI防治藥物提供薪思路。
　　方法:收集CI患者及健康對(duì)照者血液標(biāo)本并提取外周血DNA，聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法對(duì)所有病例和正常對(duì)照組人群CD40 rs1883832(C

4、/T)多態(tài)性進(jìn)行基因分型;ELISA試劑盒檢測(cè)正常組和病例組三種基因型個(gè)體血漿sCD40L水平;實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定CI患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中CD40mRNA表達(dá);x2檢驗(yàn)比較病例和對(duì)照人群CD40 rs1883832(C/T)基因型分布的異同;非條件Logistic回歸分析確定CD40 rs1883832(C/T)多態(tài)性對(duì)CI易感性的影響;單因素方差分析(ANOVA)比較不同基因型個(gè)體血漿sCD40L水平和不同基因型個(gè)

5、體PBMCs中CD40表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1、785例健康對(duì)照人群中rs1883832多態(tài)性位點(diǎn)CC、CT和TT基因型分布頻率分別為35.4％、48.4％和16.2％;473例CI患者中CD40 rs1883832(C/T)多態(tài)性位點(diǎn)CC、CT和TT基因型分布頻率分別為28.1％、53.5％和18.4％，病例和對(duì)照人群中該位點(diǎn)基因型分布均符合Hardy-Wenberg平衡，CI病例組和對(duì)照組間CD40rs1883832多態(tài)性位點(diǎn)

6、三種基因型分布具有顯著差異，P值為0.028。通過對(duì)性別、年齡及CI病因分層分析發(fā)現(xiàn):1）較正常對(duì)照組男性，病例組男性CC基因型頻率顯著降低(P=0.013);2)在50歲以上人群中，CI患者較同年齡層健康對(duì)照人群CD40 rs1883832 CC基因型分布頻率顯著降低(P=0.006);3)與對(duì)照組比較，腔隙梗死性CI患者CC基因型分布頻率顯著降低(P=0.028)。
　　2、CD40 rs1883832多態(tài)性位點(diǎn)基因型為TT和

7、CT的男性CI患者血漿sCD40L水平較CC基因型個(gè)體顯著升高(P＜0.05)。
　　3、CD40 rs1883832多態(tài)性位點(diǎn)TT基因型個(gè)體PBMCs中CD40mRNA表達(dá)水平顯著高于該位點(diǎn)CC、CT基因型個(gè)體(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1）CD40rs1883832(C/T)多態(tài)性位點(diǎn)與漢族人群CI易感性相關(guān)，攜帶該位點(diǎn)T等位基因可增加漢族人群CI的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn);
　　2）CD40 rs1883832多態(tài)性位點(diǎn)T等位

8、為危險(xiǎn)等位基因。
　　第二章 CD40介導(dǎo)姜黃素對(duì)血管緊張素Ⅱ、同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用研究
　　研究背景:腦梗塞(cerebral infarction，CI)，是一類嚴(yán)重危害人類健康的腦血管疾病，主要由動(dòng)脈粥樣硬化引起，以腦組織發(fā)生缺血、缺氧、壞死而引起的神經(jīng)功能障礙為主要臨床表現(xiàn)。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管組成的重要細(xì)胞之一，合成和釋放多種血管活性因子，在腦血管病的自身調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，血管內(nèi)皮損傷是多種心血管疾

9、病的始動(dòng)因素。內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)有CD40蛋白，CD40活化后可激活包括核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在內(nèi)的下游信號(hào)通道，上調(diào)促炎和促血栓基因的表達(dá)，進(jìn)而影響內(nèi)皮及循環(huán)功能。姜黃素(curcumin)是從植物姜黃中提取的一種黃色酸性酚類物質(zhì)，是姜黃發(fā)揮藥理作用的主要活性成分。姜黃素可多途徑抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活，下調(diào)包括多種NF-κB下游基因的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗增殖等多種藥理學(xué)效應(yīng)。
　　目的:探討血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、同型

10、半胱氨酸(Hcy)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷中CD40的表達(dá)變化，以及姜黃素對(duì)血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用是否通過抑制CD40信號(hào)通路所介導(dǎo)。
　　方法:AngⅡ造模實(shí)驗(yàn)分設(shè)正常對(duì)照組、AngⅡ損傷模型組(AngⅡ10-5M)、AngⅡ損傷與姜黃素低中高劑量(10-6M、3×10-6M、10-5M)共同作用組、陽性藥物組（AngⅡ10-5M+替米沙坦10-5M）。Hcy造模實(shí)驗(yàn)分設(shè)正常對(duì)照組、Hcy損傷模型組（Hcy10-3M）、Hcy損傷與姜

11、黃素低中高劑量（10-6M、3×10-6M、10-5M）共同作用組、陽性藥物組（瑞舒伐他汀10-5M）。Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡;Real-time PCR檢測(cè)HUVEC-C細(xì)胞中CD40 mRNA表達(dá)水平;WesternBlot檢測(cè)HUVEC-C細(xì)胞中CD40蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1、AngⅡ可顯著上調(diào)HUVEC-C內(nèi)皮細(xì)胞中CD40 mRNA的表達(dá)，與正常組比較，差異具有顯著性(P＜0.05);不同濃度姜黃

12、素預(yù)處理能抑制AngⅡ所致CD40 mRNA的上調(diào)，且姜黃素高濃度組能顯著抑制AngⅡ所致CD40 mRNA的上調(diào)(P＜0.05);
　　2、AngⅡ能明顯上調(diào)CD40蛋白表達(dá)，與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P＜0.05);高濃度姜黃素預(yù)處理能顯著抑制AngⅡ所致CD40蛋白表達(dá)的上調(diào)，與AngⅡ組比較具有顯著性差異(P＜0.05);
　　3、Hcy可顯著上調(diào)HUVEC-C細(xì)胞中CD40 mRNA的表達(dá)，與正常組比較，差異具有

13、顯著性(P＜0.05)，不同濃度姜黃素預(yù)處理可抑制Hcy所致CD40 mRNA的上調(diào)，高濃度姜黃素可顯著抑制Hcy所致CD40 mRNA的上調(diào)(P＜0.05);
　　4、Hcy能明顯上調(diào)CD40蛋白表達(dá)，與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P＜0.05);高濃度姜黃素預(yù)處理能顯著抑制Hcy所致CD40蛋白表達(dá)的上調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:姜黃素可下調(diào)AngⅡ、Hcy誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC-C) CD40 mRNA

14、和蛋白表達(dá)的增加，對(duì)AngⅡ、Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷起保護(hù)作用。
　　第三章姜黃素對(duì)PBMCs中CD40表達(dá)的影響及與CD40基因多態(tài)性的關(guān)系
　　研究背景: CD40/CD40L信號(hào)通路是T細(xì)胞活化的重要輔助刺激通路，不僅在調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，而且也在B細(xì)胞的活化、增殖、分化、抗體的分泌中起重要作用。CD40/CD40L系統(tǒng)通過外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)介導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)可能參與了AS斑塊的發(fā)生、發(fā)展、破裂和

15、血栓的形成。CD40 rs1883832位點(diǎn)能夠通過改變CD40/CD40L系統(tǒng)的水平而影響心、腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展。原代PBMCs可以進(jìn)行基因分型，是考察CD40 rs1883832基因多態(tài)性對(duì)損傷及藥物反應(yīng)性差異研究的最佳細(xì)胞模型。
　　目的:培養(yǎng)CD40 rs1883832 SNP位點(diǎn)不同基因型個(gè)體原代PBMCs，研究Hcy損傷以及姜黃素對(duì)CD40不同基因型個(gè)體PBMCs中CD40表達(dá)的影響，以探討Hcy的損傷作用以及姜黃素

16、的治療作用與CD40基因多態(tài)性之間是否存在關(guān)聯(lián)。
　　方法:收集健康志愿者外周血30 mL，提取外周血基因組DNA，并進(jìn)行基因分型，同時(shí)分離提取外周血PBMCs，培養(yǎng)后分為溶媒組，Hcy造模組、Hcy損傷與1×10-5mol/L姜黃素共同作用組、瑞舒他汀（陽性藥物）組進(jìn)行預(yù)處理，Real-time PCR檢測(cè)PBMCs中CD40mRNA表達(dá)水平;Western Blot檢測(cè)PBMCs中CD40蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1、1

17、0-3M Hcy處理PBMCs24h后，攜帶CD40 rs1883832T等位的PBMCs CD40 mRNA的表達(dá)水平增加3倍，攜帶T等位的PBMCs CD40 mRNA的表達(dá)水平是CC基因型的2倍;
　　2、10-3M Hcy顯著上調(diào)CD40蛋白的表達(dá)，攜帶CD40 rs1883832T等位的PBMCs CD40蛋白上升程度顯著高于未攜帶T等位個(gè)體;
　　3、姜黃素和瑞舒伐他汀可阻斷Hcy誘導(dǎo)的CD40水平的升高，攜帶C