CD40L-CD40及CD40突變體在人多發(fā)性骨髓瘤中的表達及其生物學意義.pdf

1、本文以CD40為靶分子，揭示了CD40分子在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。腫瘤細胞可以通過共表達CD40和CD40L分子，給予自己持續(xù)性的激活信號，使腫瘤細胞不受外界因素調控而惡性增殖，但只要阻斷CD40信號傳導過程中的任一分子都能抑制這種持續(xù)性激活信號，抑制腫瘤細胞惡性增殖，甚至誘導腫瘤細胞凋亡。同時發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞表面表達的CD40分子有突變，且這些突變是腫瘤特異性的，由此提示，可以結合抗體技術研究針對腫瘤突變分子的特異性抗

2、體，進行腫瘤的靶向治療。隨著生產(chǎn)單克隆抗體新方法和新技術的不斷出現(xiàn)，治療性抗體的療效將大大提高，毒性將越來越小，針對表達于腫瘤并具有生物學功能的突變體分子的治療性單抗將具有重要的臨床應用價值。全文主要內容如下： 一、多發(fā)性骨髓瘤細胞CD40／CD40L共表達及其生物學意義。 研究目的：探討CD40L／CD40共表達引起的IL-6自分泌對多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生，發(fā)展的影響。 研究方法：通過RT-PCR，F(xiàn)CM，激光共聚焦

3、顯微鏡技術，Western-blot和免疫沉淀技術對CD40L／CD40分子在MM細胞上的共表達及產(chǎn)生的生物學功能進行研究。 研究結果：(1)多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞呈現(xiàn)共表達CD40和CD40L分子，這些共表達的CD40和CD40L分子可以與CD40分子的下游信號分子TRAF2，TRAF6等共定位，持續(xù)性激活NF-rB，誘導MM細胞自分泌生長因子IL-6，使MM細胞可以不依賴于骨髓基質細胞提供生長因子而增殖，這為闡述MM細胞脫

4、離了骨髓微環(huán)境后仍能惡性增殖提供了理論依據(jù)：(2)進一步的研究發(fā)現(xiàn)，新鮮分離的MM病人骨髓瘤細胞幾乎都共表達CD40和CD40L分子，其中晚期病人特別是已發(fā)展為漿細胞性白血病病人的MM細胞上，都異常高地表達CD40和CD40L分子。異位表達的CD40L分子在MM細胞上的表達量與疾病的惡性程度和預后有很高的相關性，細胞上CD40L表達高的病人，惡性程度大且預后差。因此CD40L的表達情況可能成為MM的臨床分期和預后評估的指標：(3)同時對

5、MM細胞株的研究發(fā)現(xiàn)，模擬骨髓微環(huán)境中的一些細胞因子(如TNFa)能上調MM細胞株上CD40和CD40L分子的表達，同時誘導MM細胞株自分泌IL-6，用CD40L的阻斷型抗體都能下調IL-6的自分泌使細胞增殖抑制，并且誘導細胞凋亡。最近的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞也共表達CD40和CD40L分子，這種共表達通過持續(xù)性的激活CD40L／CD40／NF-rtB通路誘導細胞在體內惡性增殖和轉移。綜上所述實驗結果表明，MM腫瘤微環(huán)境中的一系列細胞因子

6、(TNFa)、粘附分子及CD40-CD40L的相互作用，介導了IL-6自分泌，這為闡明MM發(fā)生、發(fā)展的分子機制提供了新思路，也提示干預CD40L／CD40共表達、共定位形成的CD40信號體可能是治療MM的新途徑。 研究結論：首次證實了MM細胞上共表達CD40L／CD40分子，并且共表達的CD40L／CD40分子誘導MM細胞自分泌IL-6，使MM細胞可以不依賴骨髓微環(huán)境通過自分泌IL-6等生長因子，促進MM細胞的生長和腫瘤的發(fā)展。

7、 二、兩種CD40突變體對多發(fā)性骨髓細胞生物學功能的影響。 研究目的：在人多發(fā)性骨髓瘤細胞中克隆到兩種CD40突變體，并研究其生物學功能分析其表達的臨床意義。 研究方法：通過RT-PCR，測序反應，生物信息學和功能性實驗等研究CD40突變體存在的意義。 研究結果：(1)多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266細胞表達突變的CD40分子，與野生型CD40相比該突變體存在一個堿基的改變，該堿基的突變直接導致第78位氨基酸發(fā)

8、生變化(CAC--}CAA，78His→78G1n)，命名為CD40突變體1(NCBIAssayId：ss23134804，ReferenceSNPId-rsl7177493)。第78位組氨酸位于胞外段第二個富含半胱氨酸的區(qū)域，在種系進化過程中高度保守，提示該位點對于維持CD40正常的結構和功能具有至關重要的作用。生物信息學結構模擬初步提示，78位氨基酸的改變導致原有的78H和74E之間的氫鍵遭到破壞，而氫鍵的作用卻對于維持生物大分子的

9、局部構象非常重要；(2)在本實驗中我們還克隆到了RPMl8226細胞表達的另一個CD40突變體(TCA→TTA，124Ser→124Leu)，命名為CD40突變體2，結構分析顯示，該突變位點位于CD40胞外段第三個結構域中，經(jīng)生物信息學研究發(fā)現(xiàn)，該位點沒有78位氨基酸保守性高，對CD40和CD40L的直接相互作用影響不大，但是由于該位點位于CD40結構外側，并且靠近CD40分子跨膜區(qū)，推測該位點的突變可能影響到CD40分子與其它協(xié)同分子

10、(co-factor)的協(xié)同作用。分別對這兩個突變點進行生物學功能的研究發(fā)現(xiàn)，U266細胞上CD40突變改變了CD40mAb(5C1D的識別位點，但是CD40L激發(fā)仍能產(chǎn)生相應的生物學效應，推測此識別位點的突變并沒有完全改變CD40與CD40L的結合以及CD40信號傳導。RPMl8226細胞上CD40突變沒有改變5C11的識別位點，有意義的是，5C11和CD40L激發(fā)對RPMl8226細胞體外都不能產(chǎn)生明顯的生物學效應，由此推測此突變體

11、2可能影響到CD40正常的信號傳導通路，雖然CD40分子激發(fā)后，TRAF2分子可以募集到CD40胞漿段，但是CD40信號傳導體的形成需要很多信號分子參與，根據(jù)此突變位點存在部位，可能與細胞表面其它共信號分子(co-factor)結合能力改變有關。 研究結論：在MM細胞上表達一些突變的CD40分子，這些突變CD40分子可能參與腫瘤細胞生物學功能的介導。 三、CD40突變體l在血液系統(tǒng)和上皮細胞性腫瘤中的表達及其生物學意義。

12、 研究目的：研究CD40突變體1在腫瘤細胞上的表達譜以及與正常CD40分子在信號傳導上差異的分子機理。 研究方法：通過FCM，AS-PCR，RT-PCR，親和力實驗等來研究CD40突變體1在腫瘤中的表達。 研究結果：(1)在部分惡性B細胞株及上皮性腫瘤細胞株表面表達有CD40突變體l，其在新鮮腫瘤組織中也有一定程度的表達。通過基因水平及蛋白水平的檢測，證實該突變體僅在腫瘤組織中特異性表達，在正常B細胞及癌旁組織中

13、不表達，由于CD40突變體l具有獨特的抗原表位，并且具有腫瘤表達的專一性，因此該突變體有望成為腫瘤新的檢測指標；(2)初步的體外實驗證實，該CD40突變體可能以同源或異源三聚體的形式參與CD40信號傳導，其募集的TRAFs分子與野生型CD40是否存在差異，這一點尚有待進一步的證實。經(jīng)過比較CD40突變體l和正常CD40分子與sCD40L的親和力，發(fā)現(xiàn)其與sCD40L的親和力明顯低于正常CD40分子與sCD40L的親和力，提示腫瘤細胞可能