有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)父系C57BL-6小鼠對(duì)子代骨骼肌mTOR信號(hào)通路的影響.pdf

1、研究目的:
　　骨骼肌占人體體重的40％以上，在機(jī)體維持代謝平衡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。骨骼肌組織具有高度的可塑性，在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，許多重要基因的程序性表達(dá)導(dǎo)致了骨骼肌細(xì)胞特異基因的表達(dá)，這些特異表達(dá)的基因之間形成了復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育。目前研究已表明，高度保守的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。眾所周知，規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)不僅可以增強(qiáng)體質(zhì)、改善肺功

2、能、降低心腦血管疾病發(fā)病率，而且可以促進(jìn)骨骼肌肥大。流行病學(xué)研究顯示，父母的營(yíng)養(yǎng)狀況、生育年齡及其所處的環(huán)境因素包括接觸毒物、內(nèi)分泌干擾物以及食物、藥品等均可影響子代的生長(zhǎng)發(fā)育。研究顯示，孕婦進(jìn)行適宜的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，不僅可以防止孕期體重過(guò)度增加、減少妊娠期疾病，而且可以影響子代的出生體重及體重指數(shù)。與運(yùn)動(dòng)干預(yù)母系F0對(duì)子代生長(zhǎng)發(fā)育影響的深入研究相比，關(guān)于有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)父系F0是否會(huì)對(duì)其子代體重及骨骼肌產(chǎn)生影響的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)父系C5

3、7BL/6小鼠進(jìn)行6周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，通過(guò)對(duì)比運(yùn)動(dòng)干預(yù)子代小鼠與正常飲食安靜組子代小鼠的體重、骨骼肌濕重及抓力的差異，并采用分子生物學(xué)技術(shù)探討對(duì)子代小鼠骨骼肌濕重產(chǎn)生影響的機(jī)制。試圖揭示規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)不僅對(duì)參與運(yùn)動(dòng)者本身的健康有益，而且會(huì)影響子代骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育。
　　研究方法:
　　(1)實(shí)驗(yàn)用C57BL/6小鼠的繁殖和選擇:同窩C57BL/6雄性小鼠(F0)自出生21天斷乳后隨機(jī)分為運(yùn)動(dòng)組(E)和安靜組(C)。同窩雌性小鼠

4、以正常小鼠飼料安靜喂養(yǎng)以備交配使用，6周后與各組雄性小鼠1∶1交配，次日晨起檢查雌鼠外陰處精栓，當(dāng)發(fā)現(xiàn)精栓后將雄鼠移出，孕鼠單獨(dú)喂養(yǎng)至分娩。其中，運(yùn)動(dòng)組的F1代雄性小鼠命名為EM，運(yùn)動(dòng)組的F1代雌性小鼠命名為EF;安靜組的F1代雄性小鼠命名為CM，安靜組的F1代雌性小鼠命名為CF;(2)運(yùn)動(dòng)方案:E組進(jìn)行為期6周、75％ VO2max強(qiáng)度的跑臺(tái)訓(xùn)練，5天/周，1次/天，60min/次;(3)F1代小鼠的抓力:F1代小鼠自出生21天斷乳后

5、，稱量并記錄小鼠體重，之后采用抓力測(cè)定儀進(jìn)行抓力測(cè)試;(4)F1代小鼠骨骼肌細(xì)胞橫截面積:F1代小鼠禁食14-16小時(shí)，稱量并記錄小鼠體重，經(jīng)腹膜下注射水合氯醛溶液麻醉后，立即分離小鼠的股四頭肌組織，經(jīng)10％中性福爾馬林固定，1周后依次經(jīng)不同濃度梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，制成石蠟切片。H&E染色石蠟切片，鏡下觀察股四頭肌細(xì)胞的大小并采用Image J軟件計(jì)算其橫截面積;(5)采用Real-time PCR法檢測(cè)F1代小鼠股四

6、頭肌組織PI3K，Akt，mTOR，S6K1以及4E-BP1 mRNA的表達(dá)水平;(6)采用Westernblot法檢測(cè)F1代小鼠股四頭肌組織PI3K，Akt, mTOR以及S6K1總蛋白的表達(dá)水平;(7)采用Western blot法檢測(cè)F1代小鼠股四頭肌組織Akt,mTOR，S6K1以及4E-BP1磷酸化蛋白的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:
　　(1) F1代小鼠表型（體重、股四頭肌濕重及股四頭肌濕重/體重）實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與CM

7、組小鼠相比，EM組小鼠體重、股四頭肌濕重及股四頭肌濕重/體重比值分別增加12.76％，23.50％及9.73％，均有顯著性差異(P＜0.05);而EF組小鼠與CF組相比，未見明顯差異;(2)F1代小鼠抓力測(cè)試結(jié)果:為了標(biāo)準(zhǔn)化，采用抓力/體重比值作為評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，與CM組小鼠相比較，EM組小鼠抓力/體重比值增加21.50％(P＜0.05);同樣，EF組小鼠與CF組相比，亦未見明顯差異;因此，以下實(shí)驗(yàn)主要對(duì)CM組和EM組小

8、鼠進(jìn)行檢測(cè);(3) F1代雄性小鼠股四頭肌細(xì)胞的橫截面積:H&E染色結(jié)果經(jīng)Image J軟件分析顯示，EM組小鼠與CM組小鼠相比，股四頭肌細(xì)胞的橫截面積增加30.26％(P＜0.05); EM組大肌細(xì)胞所占比例顯著高于CM組，而小肌細(xì)胞所占比例顯著低于CM組(P＜0.05);(4)F1代雄性小鼠股四頭肌組織PI3K，Akt，mTOR,S6K1以及4E-BP1 mRNA的表達(dá)水平:EM組小鼠股四頭肌PI3K，Akt，mTOR, S6K1以

9、及4E-BP1 mRNA的表達(dá)較CM組分別增加16.87％，10.96％，22.48％，83.12％和73.26％，但只有S6K1和4E-BP1 mRNA的表達(dá)增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);(5)F1代雄性小鼠股四頭肌組織PI3K，Akt, mTOR以及S6K1總蛋白的表達(dá)水平:EM組小鼠股四頭肌PI3K，Akt，mTOR以及S6K1總蛋白表達(dá)水平與CM組相比有增加趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);(6)F1代雄性小鼠股四頭

10、肌組織Akt，mTOR，S6K1以及4E-BP1磷酸化蛋白的表達(dá)水平:EM組小鼠股四頭肌pAkt，pmTOR，pS6K1以及p4E-BP1蛋白的表達(dá)水平顯著高于CM組，分別增加14.63％，14.83％，92.74％和74.11％(P＜0.05)，其中pS6K1和p4E-BP1蛋白的表達(dá)增加較為顯著。
　　研究結(jié)論:
　　(1)6周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)父系小鼠可引起雄性子代小鼠的體重、股四頭肌濕重以及股四頭肌細(xì)胞的橫截面積均明顯

11、高于正常飲食安靜組的雄性子代小鼠;而對(duì)雌性子代小鼠未見明顯影響;
　　(2)6周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)父系小鼠導(dǎo)致雄性子代小鼠的抓力明顯高于正常飲食安靜組雄性子代小鼠的抓力;而對(duì)雌性子代小鼠未見明顯影響;
　　(3)6周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)父系小鼠后，其雄性子代小鼠骨骼肌組織mTOR信號(hào)通路的活性明顯高于正常飲食安靜組的雄性子代小鼠，提示，父系6周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)促進(jìn)其雄性子代小鼠骨骼肌增生的機(jī)制可能與子代雄性小鼠骨骼肌組織mTOR信號(hào)通