病毒樣顆粒構(gòu)建和治療性降壓疫苗的研究.pdf

1、第一部分噬菌體病毒樣顆粒的制備及改建
　　目的:我們已成功構(gòu)建了直徑約30nm的Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒(Qβ-2aaVLP)。降壓疫苗強(qiáng)調(diào)對(duì)Th2型體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo),20-200nm范圍內(nèi)更大直徑的載體可能更利于誘導(dǎo)2型免疫應(yīng)答;VLP具有良好的內(nèi)部包裹呈遞能力。為了增強(qiáng)降壓疫苗的免疫效應(yīng),對(duì)更大直徑VLP的構(gòu)建及小直徑VLP的改裝就顯得十分必要。本研究將探索性地構(gòu)建66nm的HK97VLP及其嵌合體,同時(shí)研究30nm的A

2、P205VLP對(duì)具有免疫刺激或免疫抑制作用的寡聚脫氧核苷酸(ODN)的包裹及其效應(yīng)。
　　方法:使用全基因合成技術(shù)合成HK97噬菌體衣殼蛋白基因(GP4和GP5)并予以擴(kuò)增,構(gòu)建雙表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-HK97,IPTG誘導(dǎo)gp4和gp5蛋白同時(shí)表達(dá)并進(jìn)行自我組裝,利用層析技術(shù)純化HK97VLP,體外酸化誘導(dǎo)其成熟,SDS-PAGE判斷其成熟度及純度,在透射電鏡下觀測(cè)其形態(tài)大小;全基因合成GP5’基因,構(gòu)建嵌合體表達(dá)質(zhì)粒pETD

3、uet-HK97-P,用相同技術(shù)方案制備嵌合體HK97-PVLP;制備HK97VLP載體疫苗,免疫SD大鼠,與嵌合體疫苗比較對(duì)抗體產(chǎn)生的輔助能力。合成AP205VLP衣殼蛋白(CP)基因,構(gòu)建其表達(dá)質(zhì)粒pET28-AP205,IPTG誘導(dǎo)CP表達(dá)及其自我組裝,純化AP205VLP,SDS-PAGE判斷其純度,并在透射電鏡下觀測(cè)其形態(tài)大小;將CpGODN2006及ODNA151包裹進(jìn)AP205VLP內(nèi)部,驗(yàn)證其包裹體對(duì)脾臟單個(gè)核細(xì)胞的刺激

4、或抑制效應(yīng)。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建HK97VLP野生型雙表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-HK97和嵌合體雙表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-HK97-P,均能進(jìn)行自我組裝成HK97VLP前體,電鏡鑒定其直徑為54nm;體外對(duì)前體進(jìn)行酸化成熟誘導(dǎo),前體成功膨脹交聯(lián)成成熟體HK97VLP,電鏡鑒定直徑為66nm;野生型耦聯(lián)疫苗與嵌合體疫苗均能強(qiáng)效輔助抗肽抗體的產(chǎn)生,并且前者稍強(qiáng)于后者。質(zhì)粒pET28-AP205表達(dá)AP205VLP成功,SDS-PAGE電

5、泳判斷其分子量正確,予以分離純化后電鏡下鑒定為自行組裝的球形顆粒,直徑約30nm;包裹CpGODN2006的AP205VLP包裹體能直接刺激脾臟單個(gè)核細(xì)胞γ-IFN的生成,包裹ODNA151的AP205VLP則顯著抑制LPS誘導(dǎo)的脾臟單個(gè)核細(xì)胞γ-IFN的生成。
　　結(jié)論:成功地構(gòu)建了直徑66nm的HK97VLP和直徑30nm的AP205VLP,并成功地完成了HK97VLP嵌合體的構(gòu)建及對(duì)AP205VLP內(nèi)部的包裹改裝,提供了更適

6、合更全面的生物靶向治療載體及新型的ODN投遞方式。
　　第二部分治療性腎素降壓疫苗的研究
　　目的:腎素作為RAS系統(tǒng)啟動(dòng)的關(guān)鍵酶分子,在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用,是理想的降壓疫苗靶點(diǎn)之一。本研究將設(shè)計(jì)出數(shù)段針對(duì)腎素的短肽,篩選出具有降壓作用的疫苗,從而發(fā)明一段或數(shù)段針對(duì)高血壓的腎素短肽疫苗。
　　方法:根據(jù)人腎素晶體衍射結(jié)構(gòu),采用生物信息學(xué)方法,按照以下方案:1)序列氨基酸必須包括腎素催化位點(diǎn)(Asp32和

7、Asp215)之一或“flap”段序列;2)與人類蛋白質(zhì)組進(jìn)行相似性比對(duì),選擇相似性低的序列;3)進(jìn)行親水性及抗原性預(yù)測(cè),選擇親水性及抗原性均較好的肽段;4)氨基酸數(shù)目不超過10個(gè)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,我們?cè)O(shè)計(jì)了6段短肽序列(rR32、rR72、rR215、hR32、hR72和hR215)作為可能的B細(xì)胞表位,用以發(fā)展腎素疫苗。將6段短肽與匙孔血藍(lán)素蛋白耦聯(lián)制備疫苗,免疫正常SpragueDawley(SD)大鼠,觀測(cè)各肽段的抗體產(chǎn)生及滴度

8、變化趨勢(shì),應(yīng)用鼠尾血壓計(jì)測(cè)量大鼠血壓變化,放射免疫分析法(RIA)測(cè)定血漿RAS變化狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取血并純化各肽段抗體,檢測(cè)各抗體與人腎素的結(jié)合能力及對(duì)血漿腎素活性(PRA)的影響。將篩選出的有效短肽疫苗免疫自發(fā)性高血壓大鼠(SHRs),觀測(cè)其血壓、抗體滴度及RAS的變化狀況,檢測(cè)腎臟有無免疫性損害;同時(shí)免疫京都Wistar大鼠(WKY),評(píng)價(jià)疫苗的初步安全性。
　　結(jié)果:所有肽段均能產(chǎn)生相應(yīng)的高滴度抗體,在63天時(shí),SD大鼠的

9、抗血清滴度范圍在1:32,000至1:80,000之間。所有抗血清在體外均可以與人腎素相結(jié)合。與對(duì)照抗血清及對(duì)照抗體相比,rR32、hR32、rR72和hR72肽段組抗血清和純化后抗體均顯著降低PRA(減少50％以上)。ELISA實(shí)驗(yàn)證明抗rR32和抗hR32抗體有著良好的交叉反應(yīng)性,而抗rR72和抗hR72抗體間交叉性很低。rR32和hR32表位疫苗對(duì)SD大鼠的血壓無明顯影響,但是顯著降低SHRs的收縮壓,最高降幅達(dá)到15mmHg(1

10、75±2vesus190±3mmHg,P=0.035;180±2vesus195±3mmHg,P=0.039)。免疫組SHRs和WKY大鼠腎臟均未發(fā)現(xiàn)明顯的免疫性損害。
　　結(jié)論:我們率先研制出了一種基于人腎素Asp32催化位點(diǎn)序列的hR32短肽疫苗。hR32短肽疫苗可抑制人腎素活性,顯著降低SHRs血壓,且在動(dòng)物體內(nèi)是初步安全的。該疫苗的研究為高血壓的治療提供了新思路和新方法。
　　第三部分ATRQβ-001降壓疫苗的機(jī)制

11、研究
　　目的:前期工作中,我們將人血管緊張素II受體1型(AT1R)胞外第二環(huán)的靶點(diǎn)短肽ATR-001與Qβ-2aaVLP載體進(jìn)行耦聯(lián),成功制備出ATRQβ-001疫苗,該疫苗能夠顯著降低SHRs的血壓并具有良好的靶器官保護(hù)效應(yīng),但是其確切的降壓及靶器官保護(hù)作用機(jī)制仍未明了。本研究將探討ATRQβ-001疫苗的降壓及靶器官保護(hù)機(jī)制。
　　方法:體內(nèi)試驗(yàn)中,將ATRQβ-001疫苗免疫SHRs和AngII誘導(dǎo)的Balb/c高

12、血壓小鼠:通過鼠尾血壓計(jì)及無線遙測(cè)技術(shù)觀測(cè)血壓;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定抗體滴度變化情況;應(yīng)用心臟超聲及病理技術(shù)觀測(cè)疫苗對(duì)模型動(dòng)物鼠心肌肥厚及纖維化的影響狀況;應(yīng)用放射免疫分析法(RIA)測(cè)定SHRs血漿RAS的變化情況及心臟和腎臟中AngII的含量;通過qRT-PCR和免疫印跡分析法(WB)分別檢測(cè)SHRs心臟和腎臟中腎素和AT1R的mRNA、蛋白表達(dá)水平。體外實(shí)驗(yàn)中,使用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)(IF)及RIA檢測(cè)抗ATR-001抗體與AT1R

13、的結(jié)合能力及抗ATR-001抗體與AngII競(jìng)爭結(jié)合AT1R的能力;通過WB檢測(cè)抗ATR-001抗體對(duì)腸系膜動(dòng)脈血管平滑肌(SASMCs)及穩(wěn)定過表達(dá)AT1RHEK293細(xì)胞系的ERK1/2磷酸化水平的影響;IF檢測(cè)抗ATR-001抗體對(duì)AngII導(dǎo)致的PKC-α轉(zhuǎn)位的影響及共聚焦顯微鏡分析對(duì)AngII引起的鈣內(nèi)流升高的影響。
　　結(jié)果:ATRQβ-001疫苗能夠有效降低SHRs血壓,最高降幅達(dá)到19mmHg(173±2vesus

14、192±3mmHg,P=0.003);降低AngII誘導(dǎo)的高血壓小鼠血壓,最高降幅達(dá)到35mmHg(143±4vesus178±6mmHg,P=0.005)。同時(shí),ATRQβ-001疫苗能夠顯著減輕高血壓導(dǎo)致的心肌肥厚和纖維化損傷,具有顯著的靶器官保護(hù)作用。與纈沙坦組導(dǎo)致的RAS激活不同,ATRQβ-001疫苗對(duì)SHRs血漿RAS無明顯影響,未見RAS的反饋激活,左室心肌和腎臟皮質(zhì)AngII的濃度三組中均未檢測(cè)到明顯差異。ATRQβ-0

15、01疫苗亦顯著降低心臟和腎臟中AT1RmRNA和蛋白表達(dá)水平。纈沙坦顯著增加腎臟腎素的mRNA表達(dá)水平,而ATRQβ-001疫苗對(duì)其表達(dá)未有明顯影響。體外實(shí)驗(yàn)中,抗ATR-001抗體能夠與SASMCs及穩(wěn)定過表達(dá)AT1RHEK293細(xì)胞系上AT1R結(jié)合,不與AngII競(jìng)爭結(jié)合AT1R。但是,抗ATR-001抗體顯著抑制AngII刺激引起的SASMCs及穩(wěn)定過表達(dá)AT1RHEK293細(xì)胞系ERK1/2磷酸化水平(72%降低,P=0.013