口蹄疫病毒嵌合病毒樣顆粒和DC靶向性重組融合蛋白的構(gòu)建及免疫效果研究.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV)引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，能造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)影響。盡管目前傳統(tǒng)疫苗在FMD防控中發(fā)揮著重要作用，但也存在缺點(diǎn)，如由于病毒滅活不徹底造成活病毒逃逸等。因此，研制安全、有效的新型疫苗是今后防控FMD的必然趨勢(shì)。
　　病毒樣顆粒(Virus-Like Particles，

2、VLPs)，由于具有與天然病毒粒子相似的結(jié)構(gòu)，及較高的免疫原性和安全性，已被廣泛地應(yīng)用到疫苗的開發(fā)和應(yīng)用中。近年來，F(xiàn)MDV VLPs相關(guān)研究顯示，相比于其它血清型FMDV，O型FMDV衣殼蛋白耐酸性較低，導(dǎo)致其在低pH值的昆蟲細(xì)胞中組裝效率差甚至不組裝。因此，本研2宄以A型FMDV AF/72株的衣殼蛋白基因P12A為骨架，將O型FMDV O/BY/CHA/2010株的結(jié)構(gòu)蛋白基因VP1嵌合入AF/72株的衣殼蛋白基因P12A中，形成

3、O-A嵌合型FMDV衣殼蛋白基因P12A(O-VP1)。通過限制性酶切位點(diǎn)將密碼子優(yōu)化合成后的嵌合衣殼蛋白基因P12A(O-VP1)和AF/72株蛋白酶基因3C，插入到帶雙啟動(dòng)子的表達(dá)載體pFastBacTM Dual中，構(gòu)建質(zhì)粒pFBDual-P12A3C(O-VP1)，轉(zhuǎn)化后篩選獲得重組桿粒rBacmid-P12A3C(O-VP1)，鑒定之后轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒rBac-P12A3C(O-VP1)。間接免疫熒光(IFA)

4、和Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，嵌合P12A(O-VP1)基因能夠在Sf9正確表達(dá)并具有良好反應(yīng)原性。電鏡觀察結(jié)果表明，嵌合P12A(O-VP1)能夠被3C蛋白裂解并自組裝形成與天然病毒粒子大小相似的VLPs。為了進(jìn)一步評(píng)估嵌合VLPs的免疫原性，將表達(dá)的嵌合VLPs與ISA-206佐劑混合乳化制備成疫苗后免疫豚鼠。結(jié)果表明嵌合VLPs疫苗能夠誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生較高水平的抗O型FMDV體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，加強(qiáng)免疫后用100GPID50

5、劑量的O型口蹄疫病毒攻擊，嵌合VLPs免疫豚鼠的保護(hù)比例為4/5，而陰性對(duì)照則5/5全數(shù)發(fā)病。本研究為今后FMDV VLPs疫苗的設(shè)計(jì)和研制提供了新的思路和依據(jù)。
　　近年來，通過將疫苗抗原特異性的靶向樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)來改善疫苗的免疫原性已成為一種新的疫苗設(shè)計(jì)策略。DC-SIGN(DC-specific ICAM-grabbing non-integrin)，又被稱為CD209，是DC膜表面的一種C

6、型凝集素受體，利用化學(xué)交聯(lián)或基因工程方法將抗原與DC-SIGN配體結(jié)合可以使抗原特異性的靶向DC，進(jìn)而顯著提高疫苗的免疫效果。因此，本研究將DC-SIGN特異性配體HIV膜糖蛋白gp120和HCV包膜糖蛋白E2，分別與口蹄疫病毒AF/72株的主要抗原蛋白VP1進(jìn)行重組融合，在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)2種DC靶向性重組融合蛋白VP1-gp120和VP1-E2，通過豚鼠免疫試驗(yàn)比較了它們及單獨(dú)表達(dá)的VP1蛋白在豚鼠模型中的免疫原性。結(jié)果表明VP1-g