TLR8激動(dòng)劑對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的調(diào)節(jié)及其在腫瘤免疫中的作用.pdf

1、目的:
　　(1)利用來(lái)源于C57BL/6小鼠的樹(shù)突狀細(xì)胞系DC2.4，探討聯(lián)合應(yīng)用人TLR8激動(dòng)劑CL075和TLR7/8調(diào)節(jié)劑Poly dT后，小鼠TLR8能否被激活以及TLR8激活以后對(duì)TLR8以及相關(guān)細(xì)胞因子如IL-10、IL-12和TNF-a表達(dá)的影響;
　　(2)建立小鼠腫瘤模型(Lewis肺癌模型)，進(jìn)一步探討TLR8激活對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響及其抗腫瘤免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)機(jī)制;
　　(3)利用臨床腫瘤標(biāo)本（人宮頸癌

2、組織）以及相關(guān)細(xì)胞系（人宮頸癌Hela細(xì)胞），觀(guān)察TLR8在人體癌組織的表達(dá)以及TLR8激活以后對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和生存的影響，以便為以TLR8為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　方法:
　　(1)在體外實(shí)驗(yàn)中，DC2.4細(xì)胞用含有10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察其經(jīng)PBS、CL075、Poly dT以及CL075與Poly dT聯(lián)合用藥刺激后的形態(tài)學(xué)變化;RT-PCR或qPT-PCR、

3、免疫熒光法以及Western-blot檢測(cè)TLR8在DC2.4的表達(dá)與分布;qPT-PCR、ELISA法檢測(cè)DC2.4經(jīng)上述藥物刺激以后相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-12和IL-10的表達(dá);MTT比色法檢測(cè)TLR8激動(dòng)劑激活受體后對(duì)DC2.4抗原提呈功能的影響;qRT-PCR與Western-blot檢測(cè)經(jīng)藥物刺激后對(duì)TLR8受體表達(dá)的影響。
　　(2)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，取純系C57BL/6小鼠，22-24克，雄性，隨機(jī)分成三組，每組

4、10只。小鼠右側(cè)腹壁消毒后，皮下注射Lewis肺癌細(xì)胞3.0×106個(gè)細(xì)胞/只，建立Lewis肺癌小鼠模型。Lewis細(xì)胞接種于小鼠當(dāng)天即開(kāi)始給藥，PBS、CL075和Poly dT均經(jīng)腹腔注射給藥。CL0750.2μg+Poly dT5μg（低劑量組）每天給藥一次，PBS組、CL0752μg+Poly dT50μ g（高劑量組）每?jī)商旖o藥一次。接種Lewis肺癌細(xì)胞第1天后，隔天用電子天平測(cè)量小鼠體重一次，7天后，用脫毛劑對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小

5、鼠進(jìn)行脫毛，觀(guān)察腫瘤的生長(zhǎng)情況。肉眼觀(guān)察并按摸皮下結(jié)節(jié)，用游標(biāo)卡尺隔天測(cè)量1次腫瘤結(jié)節(jié)的長(zhǎng)徑a及短徑b，單位mm，根據(jù)公式V=1/2×a×b2估算腫瘤體積。給藥后第二十一天，在麻醉狀態(tài)下斷頸處死小鼠，取出腫瘤組織，用電子天平稱(chēng)重，計(jì)算每組平均瘤重，qRT-PCR檢測(cè)小鼠脾臟及引流淋巴結(jié)中TLR8、IL-12、TNF-α、IL-10、TGF-β和Foxp3的表達(dá)，F(xiàn)CM檢測(cè)小鼠脾臟及引流淋巴結(jié)中CD11c+細(xì)胞TLR8的表達(dá)，F(xiàn)CM檢測(cè)小

6、鼠脾臟及引流淋巴結(jié)中CD3+CD8-IFN-γ+T細(xì)胞、CD3+CD8+IFN-γ+T細(xì)胞以及CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的比例。
　　(3)臨床標(biāo)本分析采用病人宮頸癌組織，并結(jié)合宮頸癌細(xì)胞系進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證工作。人宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞用含有10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。采用RT-PCR/qRT-PCR、免疫熒光法檢測(cè)Hela細(xì)胞TLR8的表達(dá)與分布，流式細(xì)胞術(shù)、MTT比色法檢測(cè)TLR8激動(dòng)劑CL075對(duì)宮頸癌細(xì)胞周

7、期和細(xì)胞凋亡的影響，qRT-PCR檢測(cè)COX-2、Bcl-2和VEGF在經(jīng)CL075刺激的人宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)。取人宮頸癌組織及健康對(duì)照組樣本，qRT-PCR檢測(cè)TLR7、TLR8與Bcl-2或VEGF的表達(dá)并分析其相關(guān)性，最后綜合分析TLR8在人宮頸癌細(xì)胞的表達(dá)及TLR8激動(dòng)劑對(duì)腫瘤增殖和存活的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，DC2.4細(xì)胞呈梭形、星狀和多角形，與成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞相比，樹(shù)狀突起不長(zhǎng)，個(gè)

8、體較小，細(xì)胞透亮，細(xì)胞核清晰。分別用PBS、CL075、Poly dT以及CL075+Poly dT刺激24 h后，繼續(xù)在光鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn):經(jīng)CL075+Poly dT聯(lián)合用藥刺激的DC2.4細(xì)胞樹(shù)突增多且伸長(zhǎng)，而未刺激、單用CL075或Poly dT刺激的DC2.4細(xì)胞樹(shù)突較短且少。RT-PCR/qPT-PCR、免疫熒光法以及Western-blot分別從mRNA水平和蛋白水平證實(shí)DC2.4細(xì)胞表達(dá)TLR8，而且TLR8主要分布于細(xì)胞漿

9、內(nèi)。通過(guò)qRT-PCR和ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，無(wú)論是mRNA水平還是蛋白水平，CL075+Poly dT聯(lián)合用藥組細(xì)胞分泌TNF-α和IL-12的水平均顯著增加（*p＜0.05），而IL-10的分泌水平顯著降低（*p＜0.05）。盡管CL075處理組細(xì)胞TNF-α mRNA、TNF-α蛋白和IL-12 mRNA水平也略有增加，但與對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Poly dT處理組DC2.4細(xì)胞TNF-α、IL-12和IL-10

10、的mRNA和蛋白表達(dá)量均無(wú)變化?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，經(jīng)CL075+Poly dT刺激72 h后的DC2.4可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖（與對(duì)照組相比，**p＜0.01），且T細(xì)胞與DC的比例為5∶1時(shí)刺激作用更明顯。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，CL075+Poly dT聯(lián)合處理組的DC2.4細(xì)胞中TLR8mRNA和TLR8蛋白的表達(dá)量明顯高于陰性對(duì)照組（*p＜0.05），CL075或Poly dT單獨(dú)處理組DC2.4細(xì)胞TLR8的表達(dá)

11、量與陰性對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。
　　(2)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腹腔注射CL075與Poly dT有效抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。CL075+Poly dT高劑量組小鼠的腫瘤體積與腫瘤重量明顯小于PBS對(duì)照組（*P＜0.05，n=10）。與PBS組相比，CL0752μg+ PolydT50μg（高劑量）組、CL0750.2μg+Poly dT5μg（低劑量）組小鼠體重?zé)o明顯差別。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高劑量CL075+Poly dT可以顯

12、著增加荷瘤小鼠脾臟和引流淋巴結(jié)IL-12 mRNA的表達(dá)，引流淋巴結(jié)中TNF-α mRNA的表達(dá)也顯著增加，而抑制性細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β和Foxp3的mRNA在脾臟和引流淋巴結(jié)中的表達(dá)量則明顯降低（與對(duì)照組相比，*P＜0.05或**P＜0.01，n=4）。流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，高劑量CL075+Poly dT可以促進(jìn)脾臟和引流淋巴結(jié)中CD3+CD8-IFN-γ+T細(xì)胞和CD3+CD8+IFN-γ+T細(xì)胞的增殖，而明

13、顯抑制CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的增殖（與對(duì)照組相比，*P＜0.05或**P＜0.01，n=6），證明CL075與PolydT聯(lián)合應(yīng)用一方面通過(guò)刺激荷瘤小鼠分泌IL-12、TNF-α等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)Th1型應(yīng)答和CD8+細(xì)胞毒作用，從而增強(qiáng)小鼠的抗腫瘤免疫應(yīng)答;另一方面，CL075與Poly dT合用，可通過(guò)減少荷瘤小鼠體內(nèi)抑制性細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β和Foxp3的表達(dá)，和抑制CD4+CD25+Foxp3+ Treg

14、細(xì)胞的增殖而負(fù)向調(diào)控腫瘤免疫耐受，從而有效增強(qiáng)了荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫應(yīng)答，延緩了腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。本研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，與高劑量CL075+Poly dT相比，低劑量CL075+PolydT抑制腫瘤生長(zhǎng)和增強(qiáng)抗腫瘤免疫的作用雖然不如高劑量明顯，但仍有一定的作用。而且，低劑量CL075+Poly dT可以明顯誘導(dǎo)脾臟和引流淋巴結(jié)中CD11c+細(xì)胞TLR8的表達(dá)，這和我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的CL075與Poly dT合用誘導(dǎo)DC2.4細(xì)胞TLR8表

15、達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。
　　(3)我們采用RT-PCR和qRT-PCR檢測(cè)了包括Hela細(xì)胞在內(nèi)的十三種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系，包括95D、HepG2、NICH446、U266、SGC、HCT-8、BGC、SW620、A549、HT1080、SKOV-3和U937等細(xì)胞TLR8的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SKOV-3、U937和Hela表達(dá)高水平的TLR8 mRNA，胃癌SGC，HCT-8，BGC，SW620，A549和HT1080表達(dá)低水平TLR8

16、;而在95D、HepG2、NICH446或U266細(xì)胞沒(méi)有檢測(cè)到TLR8 mRNA。TLR8 mRNA在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于其他細(xì)胞系，免疫熒光染色表明Hela細(xì)胞表達(dá)TLR8蛋白，而且TLR8分布于細(xì)胞漿內(nèi)。用不同濃度的TLR8激動(dòng)劑CL075處理HeLa細(xì)胞48小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)G2/M+S期細(xì)胞的百分比增加，提示細(xì)胞增殖增加，這一結(jié)果被MTT法進(jìn)一步證實(shí)。不同于順鉑，CL075沒(méi)有誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。CL07

17、5(1μg/ml)處理24小時(shí)后，Hela細(xì)胞中COX-2，BCL-2和VEGF mRNA水平顯著增加并在48小時(shí)達(dá)到峰值。定量RT-PCR結(jié)果表明，與沒(méi)有癌癥患者的宮頸組織相比，宮頸癌患者組織樣本中TLR7和TLR8的mRNA水平增高。與此相反，TLR9在癌癥患者和對(duì)照組組織樣本中的表達(dá)沒(méi)有明顯差異，此外，Bcl-2和VEGF在宮頸癌患者的癌組織中的表達(dá)水平也顯著增加。采用Spearman分析，我們發(fā)現(xiàn)宮頸癌樣本中TLR8和Bcl-2

18、或VEGF的表達(dá)水平之間存在正相關(guān)，而TLR7和Bcl-2或VEGF mRNA表達(dá)水平的變化并無(wú)明顯相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　(1)人TLR8激動(dòng)劑CL075與TLR7/8調(diào)節(jié)劑Poly dT聯(lián)合應(yīng)用可以有效激活小鼠TLR8，而且小鼠TLR8活化以后產(chǎn)生與人TLR8相似的效應(yīng)，如誘導(dǎo)髓系樹(shù)突狀細(xì)胞分泌TNF-α、IL-12，減少I(mǎi)L-10的分泌，有利于誘導(dǎo)Th1型免疫，增強(qiáng)DC的抗原提呈功能。因此，可以將[CL075+Pol

19、y dT]作為工具藥，以小鼠為模型體內(nèi)外研究TLR8的功能。
　　(2) TLR8可以作為腫瘤免疫治療的重要靶點(diǎn)。在體外，TLR8激動(dòng)劑誘導(dǎo)DC2.4分泌TNF-α和IL-12，增強(qiáng)DC2.4的抗原提呈功能，而且這些作用可能和DC2.4細(xì)胞TLR8的上調(diào)有關(guān);在體內(nèi)，TLR8激動(dòng)劑促進(jìn)荷瘤小鼠Th1型免疫應(yīng)答炎性細(xì)胞因子（TNF-α和IL-12）的產(chǎn)生、減少包括IL-10，TGF-β和Foxp3的免疫抑制因子的分泌，刺激CD3+C

20、D8-IFN-γ+T細(xì)胞和CD3+CD8+IFN-γ+T細(xì)胞的增殖，抑制CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的增殖，從而增強(qiáng)Lewis肺癌模型小鼠的抗腫瘤免疫應(yīng)答，延緩腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，并且小劑量CL075+PolydT上調(diào)樹(shù)突狀細(xì)胞TLR8的表達(dá)以增強(qiáng)其對(duì)激動(dòng)劑的反應(yīng)。這些結(jié)果表明，TLR8的活化以及DC等免疫細(xì)胞TLR8的上調(diào)有利于增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。
　　(3)然而，不同的腫瘤以及發(fā)生于不同個(gè)體的同一種腫瘤具有明顯的非均一性，