大氣細顆粒物對G蛋白偶聯(lián)受體激酶4的異常調(diào)節(jié)在尿鈉排泄中的作用.pdf

1、一、研究背景
　　原發(fā)性高血壓病(Essential Hypertension，EH)是心血管疾病(cardiovasculardisease，CV)的重要危險因素，高血壓及其相關并發(fā)癥已成為全球主要致死因素及疾病負擔因素，因此明確高血壓的發(fā)病危險因素及其作用機理對于高血壓病的防治具有重要的意義。
　　近年來環(huán)境因素在導致心血管疾病中所產(chǎn)生的作用日漸受到重視。越來越多的研究證實暴露于環(huán)境污染物中可嚴重影響人類健康并誘發(fā)疾病，

2、特別是環(huán)境污染與心血管疾病的關系已成為近年來研究的熱門課題。據(jù)報道，大氣中的懸浮顆粒物對人體健康的危害日益受到重視;其中，粒徑≤2.5μm的可吸入細顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)的危害最為巨大。目前多項循證醫(yī)學證實PM2.5與人群心血管疾病關系密切。有研究結(jié)果表明，PM2.5與心血管疾病死亡相關性的強度大于與呼吸道疾病死亡的相關性。同時，心臟病康復患者暴露于PM2.5，可使收縮壓和舒張壓分別升高。此

3、外，據(jù)研究證實:隨著周圍環(huán)境總懸浮顆粒物(total suspended particles，TSP)的增加，收縮壓呈現(xiàn)正相關上升趨勢。
　　雖然PM2.5可導致人群血壓升高，但其具體機制尚不完全明確。以往相關機制研究主要集中在PM2.5對血管功能的影響部分，而PM2.5對其他調(diào)節(jié)改變血壓因素是否存在作用有待明確。有研究表明，生活環(huán)境中的PM10與夜間血壓升高及日間尿鈉排泄的減少明顯相關，揭示出大氣顆粒物對腎臟調(diào)節(jié)尿鈉排泄功能的影

4、響，同樣地，PM2.5是否也可能影響到腎臟的尿鈉排泄尚不明確。為此設計本研究，并發(fā)現(xiàn)PM2.5可影響Wistar-Kyoto(WKY)大鼠的血壓及尿鈉排泄。
　　眾所周知，腎臟作為體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓的重要臟器，在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著無可替代的作用。多巴胺受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)，可分為兩類:D1類(D1、D5亞型)和D2類(D2、D3、D4亞型)，其磷酸化主要受G蛋白偶

5、聯(lián)受體激酶(G protein-coupled receptor kinase，GRK)的影響。目前有研究發(fā)現(xiàn)，GRK的其中一個亞型-G蛋白偶聯(lián)受體激酶4(G protein-coupled receptor kinase4，GRK4)的表達主要集中在腎臟、血管、心臟等組織，其活性改變早于高血壓的發(fā)生。高血壓患者或自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHRs)的GRK4蛋白表達及活性增加，可

6、導致多巴胺D1受體高度磷酸化，引起多巴胺D1受體和G蛋白失偶聯(lián)，從而導致多巴胺D1受體功能喪失，使其失去對Na+-K+-ATP酶等鈉泵的抑制能力，造成機體內(nèi)水鈉潴留，血壓升高。
　　基于上述結(jié)果，我們提出假設:PM2.5可通過調(diào)節(jié)GRK4影響腎臟水鈉排泄，升高血壓。本研究證實了PM2.5通過mRNA和蛋白水平影響RPT細胞(renal proximaltubule cells，RPTc)的GRK4表達，進而作用于多巴胺D1受體表達

7、，改變Na+-K+-ATP酶活性而影響腎臟水鈉排泄，并升高WKY大鼠血壓。
　　二、研究目的
　　探討PM2.5對腎臟近曲小管上皮細胞的G蛋白偶聯(lián)受體激酶4的異常調(diào)節(jié)，驗證其在影響高血壓中的作用。
　　三、研究內(nèi)容
　　1、建立WKY大鼠的PM2.5暴露模型，觀察其對血壓及尿鈉排泄的影響。
　　2、觀察PM2.5對WKY大鼠腎臟GRK4表達的影響。
　　3、觀察不同PM2.5劑量對腎臟近曲小管上皮(R

8、PT)細胞活力的影響，建立細胞暴露模型。
　　4、確定PM2.5對RPT細胞鈉鉀調(diào)節(jié)功能的影響是否通過GRK4，進而影響D1的表達和功能發(fā)揮該影響。
　　5、觀察PM2.5對RPT細胞氧化應激指標(SOD、MDA)的影響，并明確其對GRK4表達、鈉鉀交換功能的影響。
　　四、研究方法
　　1、給予PM2.5氣道灌注建立WKY大鼠的染毒模型，暴露期為8周，暴露后做肺組織切片HE染色，確定模型成功，觀察其血壓與對照組

9、之間的變化。并將PM2.5暴露后的WKY大鼠用代謝籠法測定其尿量，并檢測尿生化指標。
　　2、常規(guī)提取WKY大鼠腎臟皮質(zhì)區(qū)的總蛋白，用Western-Blot方法檢測其GRK4蛋白表達變化。
　　3、常規(guī)培養(yǎng)RPT細胞株，給予不同劑量PM2.5（10、50、100μg/ml）暴露RPT細胞株24小時后，用CCK8試劑盒檢測其細胞活力。
　　4、用哇巴因法檢測RPT細胞株的Na+-K+-ATP酶活性，并用D1受體激動劑（

10、非諾多泮）刺激，觀察其活性的變化。再用小干擾RNA(siRNA)沉默暴露組RPT細胞株的GRK4后，給予非諾多泮刺激，再測定其Na+-K+-ATP酶活性變化。
　　5、將各實驗組RPT細胞株常規(guī)提取總蛋白，用Western-Blot方法檢測其GRK4和D1蛋白表達變化。用Trizol法提取各實驗組RPT細胞株的RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到其cDNA，用實時熒光定量PCR(q-PCR)檢測其mRNA表達。
　　6、用PM2.5干預RPT

11、細胞株24小時后，用SOD和MDA試劑盒檢測相關活性，再用氧化應激抑制劑Tempol進行干預，觀察前后SOD、MDA活性變化情況和GRK4蛋白表達、Na+-K+-ATP酶活性變化。
　　五、研究結(jié)果
　　1、8周長期給予PM2.5暴露后，WKY大鼠的血壓高于對照組，暴露組的尿量、尿鈉較對照組下降。
　　2、暴露于PM2.5的WKY大鼠，其腎臟GRK4表達高于對照組。
　　3、用CCK8法檢測細胞活力發(fā)現(xiàn):和對照組

12、相比，實驗所選用的PM2.5各劑量組均未出現(xiàn)明顯的細胞活力下降。
　　4、干預組(10μg/mL、100μg/mL) RPT細胞株的Na+-K+-ATP酶活性高于對照組，分別給予D1受體激動劑（非諾多泮）后，對照組的Na+-K+-ATP酶活性下降，而干預組的Na+-K+-ATP酶活性無相應下降。沉默暴露組的GRK4后，給予非諾多泮刺激，再次檢測發(fā)現(xiàn)干預組的Na+-K+-ATP酶活性較沉默前明顯下降，D1R蛋白表達有所恢復。

13、　　5、干預組RPT細胞株的GRK4蛋白表達和mRNA表達高于對照組，D1蛋白表達量低于對照組。
　　6、干預組RPT細胞株的SOD活性低于對照組，MDA水平高于對照組。在給予Tempol干預后，暴露組的SOD活性較干預前有升高，MDA水平較干預前有下降。Tempol干預后RPT細胞株的GRK4表達較PM2.5干預組有降低，Na+-K+-ATP酶活性較PM2.5干預組下降，對非諾多泮的反應性有所恢復。
　　六、結(jié)論