ERS在腺苷誘導的心肌保護中的作用及其機制.pdf

1、隨著溶栓療法、經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）、冠狀動脈旁路移植術等治療方法廣泛應用于臨床，急性心肌梗死的治療也進入了再灌注時代。但臨床治療發(fā)現(xiàn)心肌在較長時間缺血造成損傷后，再次恢復供血不但不減輕或逆轉心肌細胞損傷，反而出現(xiàn)細胞損傷加重現(xiàn)象，出現(xiàn)心肌頓抑、心律失常、心肌細胞壞死等再灌注損傷問題。因此，如何減輕再灌注損傷（ischemia reperfusion inju

2、ry，IRI），最大限度保護缺血心肌，對于挽救瀕死心肌，改善預后具有重要的臨床意義。
　　近年來，不同的動物模型實驗證實，腺苷及其受體激動劑均具有對缺血/再灌注損傷心肌的保護效應，并且其保護效應可被腺苷受體抑制劑所抑制。腺苷作為機體能量代謝的產物主要源于ATP降解。研究報道心臟短暫缺血后可引起大量ATP降解，導致局部心肌組織腺苷積聚。腺苷可以觸發(fā)或介導缺血預適應(ischemic preconditioning)，減輕再灌注損傷，

3、在缺血預處理中起著非常重要的作用，腺苷作為內源性活性物質，不僅主導了早期保護機制，而且在延時保護時也發(fā)揮了重要作用。腺苷受體目前發(fā)現(xiàn)至少有4種，即A1、A2a、A2b和A3受體[2]，其中A2受體可能在后處理心肌保護效應中起著關鍵的作用。最近的研究表明，一些腺苷擬似劑可選擇性地通過A2受體發(fā)揮心臟保護作用，但其具體作用機制尚未完全闡明。
　　Hausenloy等人提出抗心肌IRI信號通路的最終步驟是抑制粒體膜通透性轉移孔（mito

4、chondrial-permeability transition pore，mPTP）的開放，而具有抑制mPTP開放作用的藥物，可以減輕心肌IRI，抑制mPTP的開放是許多心臟保護物質抗IRI的共同機制。糖原合成激酶3β（GSK-3β）是一個多功能的絲氨酸/蘇氨酸類激酶，在體內具有非常重要的生物學功能。研究證明，GSK-3β是許多心肌保護信號轉導通路的共同作用靶點，抑制GSK-3β的活性可阻止mPTP的開放，進而減輕心肌IRI。

5、>　　內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）指細胞內、外環(huán)境的改變，導致內質網內未折疊蛋白質的聚集、鈣穩(wěn)態(tài)破壞、生理功能紊亂的一種亞細胞器的病理過程。ERS是應激時發(fā)生在細胞中的最初反應，可進一步介導線粒體應激和核應激，近年來其在IRI的作用也在很多實驗中得到證實。葡萄糖調節(jié)蛋白(glucose-regulated protein，GRP78、GRP94)作為內質網上的伴侶蛋白，被認為是內質網應激

6、的標志物。Martindale等人通過實驗發(fā)現(xiàn)，當新生小鼠心肌細胞在體外經缺血再灌注處理后，ERS誘導的未折疊蛋白反應的標志物GRP78和GRP94的表達水平升高，提示缺血再灌注誘導了ERS反應。Zhang等人在體外大鼠心臟缺血再灌注模型上，發(fā)現(xiàn)Ghrelin能通過抑制ERS保護IRI導致的心肌損害。然而，腺苷及其受體的心臟保護作用是否通過ERS途徑尚不清楚。
　　目的：探討NECA是否通過減輕ERS使GSK-3?失活，進而阻止m

7、PTP的開放并保護缺血/再灌注心肌。
　　方法：實驗一研究對象選用大鼠胚胎心臟組織來源的H9c2細胞株。用800μM H2O2處理H9c2細胞，造成細胞的氧化應激損傷。熒光染色使用四甲基羅丹明乙酯（tetramethyrhodamine ester，TMRE），應用激光共聚焦顯微鏡成像技術，以543nm的氬離子激發(fā)光采集圖像，觀察細胞TMRE熒光及給予相應處理后熒光的變化，測定H9c2細胞線粒體膜電位（mitochondrial

8、membrane potential,?Ψm）的改變，以此判斷mPTP的開放程度也即線粒體的損傷程度。通過免疫熒光法及Western blot法，檢測GSK-3β（Ser9）的磷酸化、血管擴張刺激磷蛋白（Vasodilator stimulated phosphoprotion,VASP）（Ser239）、GRP94的改變。探討腺苷A2受體激動劑（5'-N-ethylcarbo-xamidoad-enosine，NECA）是否通過抑制

9、ERS使 GSK-3β失活，進而阻止 mPTP的開放而發(fā)揮其心臟保護作用，探討NECA使GSK-3β失活的相關信號轉導機制。
　　實驗二選用雄性Wistar大鼠，體重為250-300 g，利用心臟Langendorff灌流裝置及結扎冠狀動脈的方法，制備大鼠離體心臟灌流模型。將大鼠隨機分為3組，對照組（缺血/再灌注（I/R）組）、NECA組（I/R+ NECA）、TUDCA（內質網應激抑制劑）組（I/R+TUDCA），分別在灌流液中

10、加入NECA或TUDCA，于再灌注10、30、60、120 min時從缺血區(qū)采集心臟組織標本。用TTC法測定心肌梗死面積，以確定NECA的心臟保護作用。用Western blot法檢測內質網應激相關分子GRP94的表達及GSK3β的磷酸化程度。用透射電鏡觀察心臟缺血/再灌注及給藥后心肌超微結構的改變。
　　結果：
　　實驗一
　?、偌す夤簿劢癸@微鏡檢測結果顯示，H9c2細胞經H2O2（800μM）處理20 min后，測

11、得TMRE熒光強度明顯降低（36.7±3.7％）。與H2O2對照組相比，使用不同濃度的NECA（0.01μM-10μM）處理細胞，均能夠抑制TMRE熒光強度的降低，其中0.1μM NECA效果最為明顯（81.0±1.1%），提示NECA抑制氧化應激引起的mPTP的開放。
　?、赪estern blot結果顯示，與對照組相比（97.1±1.3%）、（123.8±4.6%），不同濃度的NECA（0.01μM-10μM）均能增加 GSK

12、-3β（Ser9）的磷酸化，同時降低GRP94的表達，其中0.1μM NECA效果最為明顯（139.4±5.2%）、（55.7±1.5%），提示NECA可以使GSK-3β失活，ERS可能參與了NECA的心肌保護作用。
　?、踂estern blot結果顯示，NECA（0.1μM）促進GSK-3β（Ser9）磷酸化的作用被PKG抑制劑KT5823（0.1μM）阻斷，提示NECA可能通過cGMP- PKG信號通路調節(jié)GSK-3β（Se

13、r9）的磷酸化而發(fā)揮其心肌保護作用。與對照組相比（102.1±2.1%）、（101.4±4.2％），NECA（0.1μM）使 VASP（Ser239）的磷酸化明顯增多（158.2±2.6%），同時使 GRP94的表達明顯降低（98.7±2.2%），此作用可被KT5823（0.1μM）所抑制(126.2±2.2%)、（119.6±2.1%），表明NECA可能通過ERS和cGMP/PKG信號通路，使GSK-3β失活而發(fā)揮其心肌保護作用。

14、r>　　④Western blot結果顯示，NECA（0.1μM）促進GSK-3β（Ser9）磷酸化的作用被ERS誘導劑2-DG（20 mM）所阻斷；與對照組相比（101.6±3.9%）（116.2±3.3％），NECA（0.1μM）使GSK-3β（Ser9）的磷酸化明顯增多（159.7±15.0%），同時使GRP94的表達明顯降低（60.5±2.6%），此作用可被2-DG（20 mM）所抑制（123.5±9.1%）、（101.2±3.

15、4%）。進一步提示NECA可能通過減輕ERS而調節(jié)GSK-3β（Ser9）的磷酸化，從而發(fā)揮其心肌保護作用。
　?、軼estern blot結果顯示，對照組相比，H2O2處理細胞導致GSK-3β蛋白的磷酸化水平顯著降低，同時使GRP94的表達明顯增加，而這一作用被NECA（0.1μM）所阻斷，表明NECA通過防止氧化應激引起的GSK-3β活化及內質網應激的發(fā)生而發(fā)揮其心肌保護作用。
　　實驗二
　　①與缺血/再灌注組（

16、I/R）（46.8±5.5%）相比，NECA和內質網應激抑制劑TUDCA使心肌梗死面積（26.5±4.9%）（36.0±5.1%）減小，提示ERS參與NECA的心肌保護作用。
　?、赪estern blot結果顯示，與對照組相比（97.1±1.3%）、（123.8±4.6%），NECA（0.1μM）和TUDCA均能抑制再灌注期GRP94的表達，增加GSK-3β的磷酸化，提示NECA可能通過抑制GSK-3β的活性和ERS的發(fā)生而保護