超聲微泡造影劑增強(qiáng)治療基因心肌轉(zhuǎn)染率的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本研究旨在探討應(yīng)用超聲微泡造影劑作為基因治療的載體，通過定位釋放技術(shù)將SERCA2a基因通過微泡造影劑的示蹤作用轉(zhuǎn)移至受損心肌微循環(huán)處，為靶向基因治療探索出一種低創(chuàng)傷、高效以及安全的的基因輸送方法。
　　 方法：將同種屬同窩別同年齡雄性SD大鼠35只，體重為250～300克，隨機(jī)分為分為3組：即假手術(shù)組、心肌梗死組和基因治療組。假手術(shù)組僅開胸不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈；其余兩組結(jié)扎冠脈左前降支近端，造成前壁心梗。將心功能符合要求、且心

2、梗后仍存活的大鼠及假手術(shù)大鼠共計(jì)29只動(dòng)物納入本研究。首先對心肌梗死組及基因治療組大鼠于心梗術(shù)前、術(shù)后1日、4周和8周進(jìn)行心臟超聲檢查，并按照不同觀察時(shí)間點(diǎn)分為術(shù)前對照、心梗1日、4周和8周共四組。使用GE Vivid 7 Dimension超聲診斷儀經(jīng)左胸壁進(jìn)行心臟超聲心動(dòng)圖檢查。分別測量超聲短軸乳頭肌水平徑向應(yīng)變率（radial strain rate，Srrad）和圓周應(yīng)變率（circumferential strain rate

3、，Srcir）的收縮期峰值應(yīng)變率Srrad-S和Srcir-S，舒張?jiān)缙诜逯祽?yīng)變率（Srrad-E）和Srcir-E，舒張晚期峰值應(yīng)變率Srrad-A和Srcir-A。測量左室二維超聲指標(biāo)。在心梗術(shù)后4周給予不同干預(yù)，即假手術(shù)組及心肌梗死組經(jīng)尾靜脈注射空載超聲造影劑；基因治療組經(jīng)尾靜脈注射rAAV2-SERCA2a基因（1.5×1011vg/ml）和微泡造影劑混合液，輸入液體量均為1.0ml。使用i13L線陣探頭經(jīng)左胸壁進(jìn)行心臟超聲心動(dòng)

4、圖檢查。儀器設(shè)置為低機(jī)械指數(shù)（MI﹦0.4）。當(dāng)心肌組織內(nèi)見微泡造影劑充盈時(shí)立即換成M3S探頭，探頭頻率為2.0～3.5 MHz，啟用二次諧波功能，發(fā)射頻率為1.3MHz，接收頻率為2.6 MHz并進(jìn)入反向編碼實(shí)時(shí)心肌造影模式，使機(jī)械指數(shù)調(diào)至1.02，利用FLASH（fast low-angle shot，F(xiàn)LASH）功能破壞心腔及心肌組織中的造影劑微泡，并進(jìn)行心電觸發(fā)，每三到六個(gè)心動(dòng)周期觸發(fā)一次，以達(dá)到定點(diǎn)爆破造影劑微泡的目的。每觸發(fā)

5、一次間隔2～5S，以利于下一心動(dòng)周期有足夠的超聲造影劑進(jìn)入心肌組織內(nèi)。于超聲爆破干預(yù)4周之后，檢測左室心功能，處死大鼠，分別取出大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及大腦組織于冰凍管內(nèi)，以RT-PCR和Westen印跡法檢測各組大鼠各主要臟器內(nèi)SERCA2a基因mRNA及蛋白表達(dá)量。以雙夾心ELISA法檢測各組大鼠血清中TNF-α、Ang II、ANP、ET-1以及IL-6等神經(jīng)內(nèi)分泌因子水平。并檢測了反映大鼠肝腎功能的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT

6、/GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）、血尿素氮（BUN）以及血肌酐（Cr）血清濃度。
　　 結(jié)果：心梗1日組Srrad-S、Srrad-E、Srci-S及Srci-E在前壁和側(cè)壁較心梗手術(shù)前相應(yīng)節(jié)段降低。心梗4周組和心梗8周組Srrad、Srcir在各節(jié)段較心梗手術(shù)前相應(yīng)節(jié)段均降低。心梗8周組左室心肌各節(jié)段Srrad、Srcir與心梗4周時(shí)相比幾無差別。在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)4周之后，治療組大鼠左室舒張末期內(nèi)徑LVDd較安慰劑組大鼠組顯

7、著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；治療組大鼠LVFS、EF則較安慰劑組大鼠組恢復(fù)，而與假手術(shù)組無差別。應(yīng)用斑點(diǎn)追蹤成像技術(shù)對各組大鼠心肌功能評價(jià)，證實(shí)在SERCA2a基因轉(zhuǎn)導(dǎo)4周之后，基因治療組大鼠乳頭肌水平各節(jié)段徑向、圓周收縮期舒張?jiān)缙趹?yīng)變率左均高于心肌梗死組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而與假手術(shù)組無差別?；蛑委熃M徑向、圓周舒張晚期多數(shù)節(jié)段應(yīng)變率較心肌梗死組有不同程度改善。此外，基因治療組二尖瓣、心尖水平短軸最大收縮

8、期旋轉(zhuǎn)角度及左室扭轉(zhuǎn)角度均高于心肌梗死組（P＜0.01）；而與假手術(shù)組無差別。此外，RT-PCR以及Westen印跡法表明，在接受超聲干預(yù)4周之后，基因治療組大鼠心肌組織SERCA2a蛋白表達(dá)較心肌梗死組明顯增加（P＜0.05），而與假手術(shù)組無差別。對基因治療組和心梗對照組大鼠其他組織間SERCA2a蛋白的表達(dá)進(jìn)行比較，除基因治療組大鼠肺臟組織SERCA2a蛋白的表達(dá)高于心肌梗死組外（P＜0.05），其余各組織兩組間SERCA2a蛋白的

9、表達(dá)無差異。以雙夾心ELISA法檢測了各組大鼠血清，基因治療組大鼠Ang II，ET-1以及ANp神經(jīng)內(nèi)分泌因子血清濃度較心肌梗死組大鼠有所恢復(fù)；而IL-6、TNF-α血清濃度則低于心肌梗死組大鼠，與假手術(shù)組大鼠濃度無差別。此外，基因治療組大鼠GPT、GOT、BUN以及Cr與假手術(shù)組無差別。
　　 結(jié)論：心梗大鼠不同時(shí)間段左室心肌功能各具特點(diǎn)，心梗4周后出現(xiàn)非梗死心肌功能失代償改變是其重要特征。超聲靶向微泡造影劑介導(dǎo)rAAV2-