重組小鼠精子蛋白Izumo的制備及其免疫避孕潛力的研究.pdf

1、【背景與目的】在眾多的免疫避孕候選抗原中,精子抗原被認為是目前最有希望和最具應(yīng)用前景的避孕疫苗靶抗原。2005年,一種新的精子特異表達的精卵融合關(guān)鍵蛋白Izumo的發(fā)現(xiàn)可能為避孕疫苗的研究提供了新思路和新材料。本課題旨在研究原核表達的重組小鼠Izumo(mIzumo)蛋白的免疫避孕潛力,為重組mIzumo蛋白是否能作為避孕疫苗候選靶抗原提供實驗數(shù)據(jù)和科學依據(jù)。
　　【材料與方法】①構(gòu)建pET28a(+)-mIzumo原核表達質(zhì)粒;

2、②在大腸桿菌中表達帶有6His純化標簽的重組蛋白6His-mIzumo;③固化Ni2+親和層析純化重組蛋白6His-mIzumo,并透析復(fù)性和Bradford法定量;④通過腹腔注射用6His-mIzumo免疫雌雄性C57BL/6小鼠;⑤Western blot檢測免疫小鼠血清抗6His-mIzumo IgG抗體的特異性;⑥ELISA檢測血清特異性抗體滴度隨免疫時間變化的規(guī)律;⑦精卵融合試驗觀察免疫血清對小鼠體外精卵融合的影響;⑧雙熒光染

3、色法對抗6His-mIzumo IgG抗體在精子上的識別部位進行定位;⑨免疫小鼠在末次免疫后第2周與正常小鼠合籠,評價其生育力。
　　【結(jié)果】①成功構(gòu)建了pET28a(+)-mIzumo原核表達質(zhì)粒;②成功表達和得到了純化的重組蛋白6His-mIzumo;③雌性和雄性免疫小鼠體內(nèi)都能產(chǎn)生血清特異性抗6His-mIzumo IgG抗體,特異性抗體與天然mIzumo存在交叉反應(yīng);④血清特異性抗6His-mIzumo IgG抗體開始出現(xiàn)

4、在第一次加強免疫后第2周,末次免疫后第2周抗體滴度達到最高并至少持續(xù)到末次免疫后第6周;⑤6His-mIzumo免疫血清完全阻斷小鼠體外精卵融合的發(fā)生;⑥抗6His-mIzumo IgG抗體特異地識別的小鼠AR精子(發(fā)生了頂體反應(yīng)的精子)頭部頂體區(qū);⑦雌性和雄性免疫小鼠的生育力與PBS對照組相比沒有明顯降低。
　　【結(jié)論】通過pET原核表達系統(tǒng)成功制備帶有6His純化標簽的重組蛋白6His-mIzumo;6His-mIzumo對于