表葡菌生物膜形成相關(guān)遺傳背景與表現(xiàn)型關(guān)系及抗生素對(duì)生物膜形成相關(guān)基因影響的研究.pdf

1、目的：了解臨床分離表皮葡萄球菌生物膜形成相關(guān)的atlE、foe和ica基因的分布及與生物膜形成表現(xiàn)型之間的關(guān)系，了解涉及調(diào)控生物膜形成的基因與生物膜形成、致病力之間的關(guān)系和規(guī)律。為探討控制由生物膜形成引起的耐藥難題提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：收集四川大學(xué)華西醫(yī)院臨床微生物室2004年5月至11月從臨床送檢標(biāo)本中分離得到的非重復(fù)不同來(lái)源表皮葡萄球菌50株，通過(guò)剛果紅試驗(yàn)和96孔平底組織培養(yǎng)盤半定量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其粘附和生物膜形成能力。并分別提

2、取細(xì)菌DNA，以種特異性管家基因16S基因?yàn)殛?yáng)性對(duì)照，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因特異片斷，瓊脂糖凝膠電泳后，記錄擴(kuò)增結(jié)果，檢測(cè)目的基因分布情況。統(tǒng)計(jì)分析生物膜形成能力與臨床來(lái)源及相關(guān)基因分布的關(guān)系。 結(jié)果：atlE和foe基因臨床分布較廣，分別占58％和80％，其在生物膜表現(xiàn)陰陽(yáng)性之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明臨床形成生物膜與它們存在并不是完全相關(guān)。icaABD基因占全部臨床分離株的36％，其攜帶與生物膜表現(xiàn)型顯著相關(guān)。攜帶全部三種基因

3、16株，其中8株生物膜陽(yáng)性，經(jīng)檢驗(yàn)相關(guān)顯著。臨床分離導(dǎo)管來(lái)源表葡菌與血液及組織感染菌株間生物膜形成能力無(wú)顯著差異。 結(jié)論：雖然已有實(shí)驗(yàn)證明atlE和fbe介導(dǎo)表葡菌生物膜形成時(shí)的初期粘附，但并非與臨床生物膜形成必然關(guān)聯(lián)。Ica基因與臨床生物膜形成顯著相關(guān)，單獨(dú)攜帶ica基因或共同攜帶3種基因形成生物膜的可能性明顯增加。說(shuō)明表葡菌生物膜形成時(shí)的初期粘附除與atlE和fbe介導(dǎo)有關(guān)外，可能還存在其它環(huán)境或遺傳調(diào)控因素。 目的

4、：探索agr系統(tǒng)在MIC抗生素作用下在表皮葡萄球菌生物膜形成、脫離過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄水平變化，從而了解抗生素在治療生物膜感染時(shí)，本身是否影響了agr系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄水平，從而通過(guò)agr系統(tǒng)介導(dǎo)了表皮葡萄球菌生物膜耐藥和持續(xù)感染，呈現(xiàn)一種新的耐藥和持續(xù)感染機(jī)制。為進(jìn)一步解決生物膜引起的臨床問(wèn)題提供理論依據(jù)。 方法：通過(guò)對(duì)倍稀釋法測(cè)定去甲萬(wàn)古霉素、利福平、阿齊霉素和苯唑西林的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentrat

5、ion,MIC)。以靜止期游離表葡菌株為對(duì)照，以gDNA為內(nèi)標(biāo)，采用SYBR實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法檢測(cè)MIC濃度的上述4種抗生素作用下從粘附開(kāi)始30分鐘、1、2、24、72小時(shí)agr系統(tǒng)的hld(RNAⅢ)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，并和無(wú)抗生素作用生物膜形成過(guò)程相應(yīng)不同時(shí)段agr系統(tǒng)hld(RNAⅢ)基因轉(zhuǎn)錄水平作比較，從而了解抗生素對(duì)agr系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄的影響和是否有通過(guò)這種機(jī)制耐藥的情況。 結(jié)果：與靜止期游離菌相比，在無(wú)抗生素

6、干預(yù)時(shí)，表葡菌在粘附開(kāi)始后，hld(RNAⅢ)的轉(zhuǎn)錄水平很快下降，從30分鐘差異即開(kāi)始明顯，并在隨后數(shù)小時(shí)繼續(xù)下降至一個(gè)較低水平， 24小時(shí)又有一個(gè)緩慢的上升趨勢(shì)，到72小時(shí)時(shí)與2小時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四種抗生素作用下生物膜形成hld(RNAⅢ)的轉(zhuǎn)錄水平經(jīng)相關(guān)性分析顯著相關(guān)，與游離菌及與無(wú)抗生素作用時(shí)配對(duì)t檢驗(yàn)差異顯著。在4種抗生素作用下，hld(RNAIII)的轉(zhuǎn)錄水平亦從粘附開(kāi)始即出現(xiàn)下降趨勢(shì)，生物膜形成初期與中后成熟期差異顯

7、著。與無(wú)抗生素作用生物膜不同，24及72小時(shí)無(wú)明顯上升趨勢(shì)。4種抗生素作用下，以利福平對(duì)hld(RNAIII)的轉(zhuǎn)錄的影響最大，與其它3種抗生素比較有顯著區(qū)別，而其它3種抗生素作用之間經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)無(wú)顯著差異。 結(jié)論：表葡菌生物膜形成過(guò)程中，agr系統(tǒng)在初期轉(zhuǎn)錄開(kāi)始下降，可能通過(guò)減少其對(duì)atlE和fbe表達(dá)的負(fù)調(diào)控而使粘附作用增強(qiáng)，生物膜形成后，無(wú)抗生素等抑制情況下，agr系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄又上調(diào)，可能通過(guò)表達(dá)包含δ-毒素的酚溶解調(diào)理素的

8、去垢劑樣作用介導(dǎo)輸水通道基質(zhì)解離和細(xì)菌脫離。在抗生素作用下，生物膜中agr系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄更為降低，在初期可能加強(qiáng)粘附，但這一作用可能會(huì)被其對(duì)游離菌的有效抑制而抵消。生物膜形成后期由抗生素抑制的低轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能更有意義，推測(cè)可能會(huì)通過(guò)減少表達(dá)包含δ-毒素的酚溶解調(diào)理素的去垢劑樣作用，導(dǎo)致輸水通道關(guān)閉和中斷基質(zhì)解離和細(xì)菌脫離，防止細(xì)菌脫離后被殺滅，從而反過(guò)來(lái)顯示對(duì)抗生素耐藥。除通過(guò)密度感應(yīng)外，利福平還可能通過(guò)了其它環(huán)節(jié)抑制了agr系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄。這可能是