解淀粉芽孢桿菌sinI基因突變株的構(gòu)建及對生物膜形成與抑菌活性的影響.pdf

1、sinⅠ基因是芽孢桿菌屬細(xì)菌的重要調(diào)控基因，sinⅠ基因不僅對細(xì)菌生物膜形成具有調(diào)控作用，而且參與了細(xì)菌抑菌活性、運(yùn)動性、芽孢形成等一系列的調(diào)控。本研究以植物內(nèi)生生防細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌PEBA20為材料，利用同源重組法構(gòu)建了sinⅠ基因缺失突變株，進(jìn)而驗(yàn)證了該基因?qū)獾矸垩挎邨U菌PEBA20菌株生物膜形成、抑菌活性和芽孢形成的影響。
　　本文主要研究結(jié)果如下:
　　1、設(shè)計(jì)了合理可行的sinⅠ基因缺失突變株構(gòu)建方案，PCR擴(kuò)

2、增獲得同源前后臂sinⅠF和sinⅠR，采用重疊延伸PCR連接同源前后臂，將sinⅠF-sinⅠR連接至自殺質(zhì)粒pK18mobsacB，構(gòu)建重組自殺質(zhì)粒sinⅠF-sinⅠR-pK18mobsacB并電轉(zhuǎn)化入PEBA20感受態(tài)細(xì)胞，采用卡那和蔗糖兩步篩選法獲得sinⅠ基因缺失的PEBA20突變株。以缺失株DNA為模板進(jìn)行PCR篩選陽性克隆，并通過測序進(jìn)一步確定獲得sinⅠ基因缺失突變株。
　　2、觀察了B.amyloliquefa

3、ciens PEBA20⊿sinⅠ突變株的液氣界面和固氣界面生物膜形成過程，發(fā)現(xiàn)⊿sinⅠ突變株固氣界面生物膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度退化，液氣界面也不能形成完整的生物膜，這表明sinⅠ基因在生物膜形成過程中起到重要作用。
　　3、持續(xù)觀察了B.amyloliquefaciens PEBA20⊿sinⅠ突變株swarming運(yùn)動性表型，結(jié)果表明，⊿sinⅠ突變株的簇動能力下降。因此sinⅠ基因缺失會影響B(tài).amyloliquefaciensP

4、EBA20菌的swarming運(yùn)動性發(fā)展。
　　4、通過皿內(nèi)離體生防活性測定，進(jìn)行了B.amyloliquefaciens PEBA20野生型菌株對蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌、蘋果炭疽病菌菌落生長及菌絲形態(tài)的抑制作用試驗(yàn)，結(jié)果表明B.amyloliquefaciens PEBA20對蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌、蘋果炭疽病菌有著良好的抑菌效果，對蘋果腐爛病的效果最佳。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，三種受抑制的病原菌邊緣菌絲的形態(tài)也產(chǎn)生了不同程度的畸

5、形變化，表明B.amyloliquefaciens PEBA20通過產(chǎn)生抗生物質(zhì)導(dǎo)致病原菌菌絲形態(tài)畸變，主要表現(xiàn)為菌絲膨大呈球狀，粗縮膨大，原生質(zhì)褐化、聚集，部分菌絲透明化。
　　5、測定了B.amyloliquefaciens PEBA20野生型菌株和⊿sinⅠ突變株對蘋果腐爛病菌、楊樹潰瘍病菌、小麥紋枯病菌、玉米小斑病菌等病原真菌和馬鈴薯環(huán)腐病菌、煙草青枯病菌、大白菜軟腐病菌三種病原細(xì)菌的抑菌活性，試驗(yàn)結(jié)果顯示，野生型菌株和⊿

6、sinⅠ突變株的抗真菌活性差異極顯著，⊿sinⅠ突變株的抗細(xì)菌活性幾乎完全喪失，表明sinⅠ影響了B.amyloliquefaciens PEBA20的抗真菌活性和抗細(xì)菌活性。
　　6、測定并對比B.amyloliquefaciens PEBA20野生型菌株和⊿sinⅠ突變株的生長曲線、芽孢和菌體形態(tài)。結(jié)果顯示⊿sinⅠ突變株群體生長受到明顯抑制，經(jīng)檢測B.amyloliquefaciens PEBA20⊿sinⅠ突變株120h仍